New England Biolabs, P8104S, Endoproteinasa AspN

La endoproteinasa AspN (flavastacina) es una metaloendopeptidasa de zinc que escinde selectivamente los enlaces proteicos y peptídicos N-terminales a los residuos de ácido aspártico. Categorías relacionadas Proteasas,, Análisis del proteoma Aplicaciones Glicómica y glicoproteómica,, Bioterapéutica y análisis de anticuerpos,, Proteómica Especificación Condiciones de reacción Tampón de reacción de endoproteinasa AspN 1X Incubar a 37 °C Tampón de reacción de endoproteinasa AspN 1X Tris-HCl 50 mM ZnSO4 2,5 mM (pH 8 a 25 °C) Concentración de uso 100 ng/μl Peso molecular Teórico: 40089,9 daltons Preguntas frecuentes P: ¿Su endoproteinasa AspN es la misma que la endoproteinasa AspN que venden otras empresas? R: No, es diferente de otras endoproteinasas AspN disponibles en el mercado. Provienen de diferentes fuentes de cepas, por lo que son enzimas diferentes con especificidades similares. La endoproteinasa AspN de NEB digiere proteínas y péptidos rápidamente, pero digiere péptidos aún más rápidamente. La endoproteinasa AspN de NEB fue caracterizada por primera vez en 1994 por Tarentino et al. y se encuentra en la base de datos MEROPS. P: La endoproteinasa AspN no se disuelve completamente cuando la reconstituyo en agua. ¿Cómo la disuelvo completamente? R: A veces se observa un precipitado en este producto, pero no parece afectar la actividad. Recomendamos mezclar y mantener el tubo en hielo durante 10 minutos, seguido de un centrifugado rápido y luego usar la enzima incluso si el precipitado aún está presente. P: ¿Qué residuos corta la endoproteinasa AspN? R: Solo hemos observado que la endoproteinasa AspN escinde residuos de Asp. P: ¿Tiene algún protocolo o sugerencias para digerir proteínas en gel con la endoproteinasa Asp-N seguida de la endoproteinasa Glu-C? Estoy siguiendo el protocolo para cada una, pero me gustaría optimizar la digestión combinada. R: Sugerimos mezclar los dos tampones enzimáticos en una proporción 1:1 de GluC:AspN. La endoproteinasa GluC preferiría tener el dipéptido EE presente para estimular la actividad, mientras que la endoproteinasa AspN requiere Zn, que está presente en el tampón AspN. Aun así, utilice una proporción de enzima a sustrato de 1:20 (peso/peso) para cada enzima. Habrá cierta reducción en la escisión de la proteína sustrato, ya que las dos proteasas se estarán masticando mutuamente. Según nuestra experiencia, estas condiciones funcionan lo suficientemente bien como para obtener un alto grado de digestión. Es posible que deba ajustar las cantidades individuales de cada enzima si falta un fragmento deseado, suponiendo que las reacciones se analizarán mediante alguna técnica de MS. Si prefiere hacer las reacciones secuencialmente, haga primero la reacción de Endoproteinasa GluC ya que la Endoproteinasa AspN tiene dificultad para digerir proteínas intactas. Todas las digestiones deben realizarse a 37 °C. P: ¿Qué tan pura es la Endoproteinasa AspN? ¿Se ha comprobado su actividad nucleasa? R: La enzima se proporciona en una forma casi homogénea y puede estar libre de nucleasas, pero no tenemos datos que respalden esto. Actualmente no tenemos ninguna prueba de control de calidad para calificar si la Endoproteinasa AspN está libre de contaminación por nucleasas. Este producto está destinado a ser utilizado en aplicaciones proteómicas donde generalmente las nucleasas no son un problema. P: Tris interferirá con mis reacciones posteriores. ¿Su Endoproteinasa AspN, cuando se reconstituye en H2O, contiene Tris-HCl? R: La respuesta es sí. Antes del secado, la endoproteinasa AspN se dializa en un tampón de NaCl 50 mM y Tris-HCl 10 mM. P: ¿Cuál es la secuencia de la endoproteinasa AspN en formato de texto? R: Aquí está la secuencia de la endoproteinasa AspN: TIVSSFIKTWPNATVYYTLPSQGSLSTQAYNTFLTNINKAFDMISSKTSV KFVQRTNQTEYITFTYSTGNSSPLGWVKNRVNGIKIYNTTYPAIIAHEIM HSMGIMHEQCRPDRDQYIIVDTNRAQDGTRHNFNLYNDYAGHGEFDFGSV MMYKSTDFAIDPNLPVMTKLDGSTFGKQRDGLSAGDYAGINHLYGPVNST SATNGTYTLTTSLAGDKNIDITGSSTADGTDVILYSATTGNNQKFIFRKS EHGYFTIKSILDSTKVLTVRNNGTANGTAVELRTNADTDAQKWLLFNLGN EGFGFAPKNAPSLRLEVKDGLTTNLTPIVIGSTDQTLQPYTKQRFTLTKVN P: ¿Se puede utilizar la endoproteinasa AspN con un tampón volátil? R: Probablemente sí, pero la reacción debe complementarse con zinc. P: ¿Qué tan estable es esta enzima? Disolvimos nuestra enzima en agua hace aproximadamente 2 semanas y la literatura indica que la actividad comenzará a disminuir después de este período de almacenamiento (y más). R: La endoproteinasa AspN almacenada a -20 °C que se ha congelado-descongelado más de una docena de veces durante un período de dos semanas debería tener una buena actividad. La enzima endoproteinasa AspN que vendemos es una apoenzima y carece del zinc necesario para la actividad. Añadimos zinc a nuestro tampón para reactivar la enzima (de ahí su buena vida útil). P: Digerí BSA con endoproteinasa AspN siguiendo las condiciones estándar y examiné los fragmentos liberados con espectrometría de masas. No vi muchos picos que coincidieran con el fragmento previsto, pero sí muchas bandas imprevistas, lo que quizás indique una actividad enzimática no específica. R: Es más probable que se trate de un caso de digestión deficiente o nula que de digestión no específica, ya que nuestra endoproteinasa AspN funciona mejor con péptidos. Como alternativa, puede realizar una "doble digestión": digerir la proteína primero con tripsina o endoproteinasa GluC para reducir su tamaño, seguida de, o en combinación con, una digestión con endoproteinasa AspN para generar péptidos con ácido aspártico N-terminal. P: ¿Se puede inactivar la endoproteinasa AspN por calor? R: La endoproteinasa AspN es una metaloenzima que utiliza iones Zn+2; por lo tanto, recomendamos inactivarla añadiendo EDTA en una concentración mayor que la de los cationes divalentes presentes en el tampón de reacción. Esta reacción es reversible si se añade más Zn+2 u otros cationes divalentes que titulan el EDTA. P: No consigo que la endoproteinasa AspN digiera mi proteína. R: Nuestra Endoproteinasa Asp N funciona mejor en sustratos peptídicos que en proteínas intactas, por lo que sugerimos utilizar otra enzima para generar primero péptidos grandes que la Endoproteinasa AspN tendrá menos problemas para digerir (una digestión doble con tripsina o Endoproteinasa GluC) o cambiar a otra fuente de Endoproteinasa AspN ya que nuestra enzima Endoproteinasa AspN es diferente de otras fuentes comerciales.