New England Biolabs, P8107S, proteinasa K, grado de biología molecular

La proteinasa K es una serina proteasa relacionada con la subtilisina que hidroliza diversos enlaces peptídicos y se utiliza frecuentemente para la purificación de reacciones enzimáticas o lisados ​​celulares. Categorías relacionadas: Proteasas, Purificación de ácidos nucleicos. Unidad de especificación. Definición: Una unidad digiere la hemoglobina desnaturalizada con urea a 37 °C (pH 7,5) por minuto para producir una absorbancia equivalente a 1,0 μmol de L-tirosina utilizando el reactivo de fenol de Folin y Ciocalteu (6). Tampón de almacenamiento 20 mM Tris-HCl 1 mM CaCl2 50% Glicerol pH 7,4 a 25 °C Inactivación por calor 95 °C durante 10 minutos Peso molecular teórico: Unidad de 28,9 kDa Condiciones de ensayo 0,5–2 μg de proteinasa K se incuban con solución de hemoglobina desnaturalizada al 2% durante 10 minutos a 37 °C (pH 7,5). Después de la precipitación, neutralización y adición del reactivo de fenol de Folin & Ciocalteu, se mide la absorbancia de los productos de escisión solubles a 750 nm. La absorbancia se compara con una curva estándar de absorbancia de L-tirosina preparada de forma similar. Preguntas frecuentes P: El protocolo que estoy usando requiere una concentración de µg/ml de proteinasa K. ¿Cuál es la concentración de proteína de la proteinasa K, grado de biología molecular? R: La concentración proteica de la proteinasa K, grado de biología molecular, es de aproximadamente 20 mg/ml y su actividad unitaria es de 800 U/ml. P: ¿Qué tampón debo usar para la proteinasa K? R: La proteinasa K es activa en una amplia gama de tampones, incluyendo todos los tampones NE para enzimas de restricción, el tampón de reacción Q5, el tampón de reacción estándar OneTaq, el tampón de reacción estándar Taq y el tampón de reacción RNAPol. La proteinasa K es activa a un pH óptimo entre 7,5 y 12,0 (Ebeling et al., 1974) y a temperaturas entre 20 y 60 °C (Bajorath et al., 1988). La actividad se estimula al incluir en la reacción hasta un 2 % de SDS o hasta 4 M de urea (Hilz et al., 1975). El calcio es importante para la termoestabilidad de la proteinasa K, pero no es necesario para la catálisis; por lo tanto, la proteinasa K también es activa en tampones que contienen agentes quelantes como el EDTA (Bajorath et al., 1988). P: Si necesito diluir la proteinasa K, grado de biología molecular, ¿cómo debo hacerlo? R: Para uso inmediato, la proteinasa K se puede diluir en tampón de reacción 1X. Para crear una solución madre que permita un almacenamiento a largo plazo, el tampón de dilución debe contener Ca++ (1 mM suele ser suficiente). P: ¿Por qué el ensayo de definición de unidad para la proteinasa K termolábil (NEB n.º P8111) es diferente del ensayo de definición de unidad para la proteinasa K, grado de biología molecular (NEB n.º P8107)? R: La proteinasa K, grado de biología molecular (n.º P8107) utiliza un sustrato de hemoglobina desnaturalizada tradicional para medir la actividad (1). Este ensayo tradicional permite comparar la actividad de la proteinasa K con el mercado actual e histórico. A lo largo de los años, la caseína también se ha utilizado como sustrato con menor precisión que la hemoglobina. La proteinasa K termolábil (#P8111) utiliza un enfoque más moderno que utiliza un sustrato de nitroanilida para medir la actividad mediante absorbancia visible. Este ensayo es el preferido por su lectura directa de la proteólisis, su sensibilidad y su compatibilidad con placas de 96 pocillos. Para el desarrollo del ensayo directo, véase Pozgay et al. (2). Referencias: Anson, ML et al. (1938) J. Gen. Physiol., 22, 78-89. «La estimación de pepsina, tripsina, papaína y catepsina con hemoglobina». Pozsgay, M. et al. (1979) Eur. J. Biochem., 95, 115-119 “Un método para diseñar sustratos peptídicos para proteasas. Sustratos de tripeptidil-p-nitroanilida para subtilisina Carlsberg”. P: ¿Cuál es la actividad de la proteinasa K de grado de biología molecular si se somete al ensayo de definición de unidad utilizado para la proteinasa K termolábil? R: La proteinasa K de grado de biología molecular produce una concentración de actividad de 800 U/mL utilizando el ensayo tradicional de actividad de hemoglobina desnaturalizada. La misma muestra produce una concentración de actividad de ~4000 U/mL utilizando el ensayo más moderno de actividad de absorbancia visible del sustrato de nitroanilida, utilizado para la proteinasa K termolábil.