New England Biolabs, P8111S, proteinasa K termolábil

La proteinasa K termolábil es una proteinasa K recombinante diseñada para una inactivación rápida y completa por calor con amplia actividad proteasa, para degradaciones de proteínas y enzimas en preparaciones de ácidos nucleicos y otras aplicaciones. Categorías relacionadas Proteasas,, Extracción y purificación de ARN total,, PCR, qPCR y tecnologías de amplificación, Aplicaciones PCR y limpieza de reacciones,, Herramientas de análisis de proteínas,, Digestión de proteínas, Definición de unidad de especificación Una unidad se define como la cantidad de enzima necesaria para liberar 1,0 µmol de 4-nitroanilina por minuto a partir de N-succinil -Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilida a 25 °C, en un volumen total de reacción de 105 μl. Tampón de almacenamiento 20 mM Tris-HCl 1 mM CaCl2 50% Glicerol pH 7,4 a 25 °C Inactivación por calor 55 °C durante 10 minutos Peso molecular aparente: Unidad de 29 kDa Condiciones de ensayo Una serie de diluciones de proteinasa K termolábil se incuban con 0,25 mM N-succinil -Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilida en 0,1% SDS, 0,1% Triton X-100, 20 mM Tris-HCl, 5 mM CaCl2, 50 mM NaCl (pH 8,0 a 25 °C) en una reacción de 105 μl. La mezcla de reacción se incuba a 25 °C. La liberación de p-nitroanilina se detecta mediante espectroscopia UV en tiempo real a 405 nm. Preguntas frecuentes P: ¿En qué se diferencia la proteinasa K termolábil de la proteinasa K de grado para biología molecular? R: La proteinasa K termolábil es una variante modificada y expresada de forma recombinante de la proteinasa K de grado para biología molecular (tipo silvestre). Los patrones de escisión de ambas enzimas son los mismos: prefieren aminoácidos aromáticos y alifáticos. La proteinasa K termolábil se puede inactivar por calor incubándola a 55 °C durante 10 minutos y mantiene su actividad óptima entre 20 y 40 °C. P: ¿Puedo usar la proteinasa K termolábil para aplicaciones de biología molecular? R: La proteinasa K termolábil no presenta actividad exonucleasa, endonucleasa ni ARNasa, y no contiene contaminación detectable de ADN (tanto bacteriano como eucariota). Por lo tanto, es ideal para aplicaciones de biología molecular e investigación genómica. P: ¿Debería cambiar de proteinasa K de grado para biología molecular a la proteinasa K termolábil? R: Si el experimento o la aplicación requieren la inactivación de la proteinasa K para permitir reacciones posteriores, entonces sí, la proteinasa K termolábil es la opción ideal. El uso de la proteinasa K termolábil permite evitar la extracción con fenol/cloroformo o la purificación en gel/columna. P: Si cambio de proteinasa K, grado de biología molecular a proteinasa K termolábil, ¿debo usar la misma cantidad de enzima? R: Para la mayoría de las aplicaciones, se puede usar el mismo volumen de proteinasa K termolábil en lugar de proteinasa K, grado de biología molecular. Este es un buen punto de partida; sin embargo, la cantidad exacta de enzima necesaria puede depender del sustrato y puede que sea necesario comprobarla empíricamente. P: ¿Cómo inactivo por calor la proteinasa K termolábil? R: Para la mayoría de los flujos de trabajo, la proteinasa K termolábil se puede inactivar por calor incubándola a 55 °C durante 10 minutos. Sin embargo, la termolabilidad de la enzima se ve afectada por la concentración de sal, el pH y la concentración de iones metálicos presentes en la mezcla de reacción. Por lo tanto, la temperatura óptima de inactivación y el tiempo de incubación pueden necesitar ser determinados empíricamente para flujos de trabajo específicos. P: ¿Qué tampón debo usar para diluir la proteinasa K termolábil? R: La cantidad de proteinasa K termolábil requerida puede depender del sustrato. Sin embargo, las condiciones típicas de reacción son 1 µl de enzima / 50 µl de volumen de reacción. Un tampón de dilución recomendado es 20 mM Tris-HCl, 1 mM CaCl2, pH 7,5 P: ¿Cuál es el tampón de reacción óptimo para la proteinasa K termolábil? R: La proteinasa K termolábil es compatible con una amplia gama de tampones: pH óptimo: 7–10 Sal: 0–1 M NaCl Tampón: Tris-HCl, HEPES, tricina y Tris-acetato. La siguiente tabla muestra las actividades relativas en tampones comunes. Buffer 1X NEB1.1 + NEB2.1 + NEB3.1 + CutSmart +++ Buffer Q5 +++ Q5 HighGC + Thermopol + T4 DNA Ligase ++ P: ¿Cuál es la temperatura y el tiempo de incubación óptimos? R: El rango de temperatura de incubación recomendado es de 20 a 40 °C. Para incubaciones de más de 1 hora, recomendamos 25 °C. El tiempo de incubación depende del sustrato y varía según el motivo de la proteólisis. Normalmente, para eliminar la actividad enzimática, una incubación de 5 a 10 minutos es adecuada. Sin embargo, puede tardar más si es necesario lisar las células, degradar los nucleosomas, escindir las histonas o si hay otras proteínas presentes. P: ¿La proteinasa K termolábil es compatible con EDTA, Triton X-100, SDS, DTT o urea? R: Sí. La proteinasa K termolábil es completamente activa en presencia de 10 mM de EDTA, 1,5 % de Triton X-100, 2,5 % de SDS, 10 mM de DTT y 1 M de urea. Recomendamos mantener estas cantidades de cada componente o menos. P: ¿Es activa la proteinasa K termolábil en los tampones NEB habituales? R: Sí, la proteinasa K termolábil es activa en los tampones NEBuffer 1.1, 2.1, 3.1, CutSmart® y el tampón de reacción de ADN ligasa T4. Otros tampones deberán probarse empíricamente. P: ¿Es activa la proteinasa K termolábil en presencia de iones metálicos? R: La proteinasa K termolábil es activa en presencia de 10 mM de CaCl₂ y 10 mM de MgCl₂. P: ¿Por qué el ensayo de definición de unidad para la proteinasa K termolábil (NEB n.º P8111) es diferente del ensayo de definición de unidad para la proteinasa K, grado de biología molecular (NEB n.º P8107)? R: La proteinasa K, grado de biología molecular (n.º P8107) utiliza un sustrato de hemoglobina desnaturalizada tradicional para medir la actividad (1). Este ensayo tradicional permite la comparación de la actividad de la proteinasa K con el mercado actual e histórico. A lo largo de los años, la caseína también se ha utilizado como sustrato con menos precisión que la hemoglobina. La proteinasa K termolábil (n.º P8111) utiliza un enfoque más moderno en el que se utiliza un sustrato de nitroanilida para medir la actividad mediante absorbancia visible. Este ensayo es el preferido por su lectura directa de la proteólisis, su sensibilidad y su compatibilidad con placas de 96 pocillos. Para el desarrollo del ensayo directo, véase Pozgay et al. (2). Referencias Anson, ML et al. (1938) J. Gen. Physiol., 22, 78-89. “La estimación de pepsina, tripsina, papaína y catepsina con hemoglobina”. Pozsgay, M. et al. (1979) Eur. J. Biochem., 95, 115-119 “Un método para diseñar sustratos peptídicos para proteasas. Sustratos de tripeptidil-p-nitroanilida para subtilisina Carlsberg”. P: ¿Cuál es la actividad de la proteinasa K, grado de biología molecular, si se somete al ensayo de definición de unidad utilizado para la proteinasa K termolábil? R: La proteinasa K, grado de biología molecular, produce una concentración de actividad de 800 U/mL utilizando el ensayo tradicional de actividad de hemoglobina desnaturalizada. La misma muestra produce una concentración de actividad de ~4000 U/mL utilizando el ensayo de actividad de absorbancia visible del sustrato de nitroanilida más moderno que se utiliza para la proteinasa K termolábil.