New England Biolabs, P8112S, proteasa TEV

La secuencia de reconocimiento de la proteasa TEV con la mayor eficiencia catalítica es ENLYFQ ▼S; sin embargo, el aminoácido en la posición P1' también puede ser G, A, M, C o H (1). Categorías relacionadas Sistema de fusión y purificación de MBP NEBExpress, Expresión de proteínas bacterianas de E. coli, Purificación de níquel (etiqueta His), Aplicaciones Escisión de proteínas de fusión, Insolubilidad de la proteína diana, Purificación de proteínas, Definición de unidad de especificación 1 unidad de proteasa TEV escindirá 2 µg de proteína de fusión MBP, MBP5-TEV-paramiosina ΔSal, hasta un 95% de finalización en un volumen de reacción total de 10 μl en 1 hora a 30 °C en Tris-HCl 50 mM (pH 7,5 a 25 °C) con EDTA 0,5 mM y DTT 1 mM. Condiciones de reacción Tampón de reacción de proteasa TEV 1X Incubar a 30 °C Tampón de reacción de proteasa TEV 1X Tris-HCl 50 mM EDTA 0,5 mM DTT 1 mM (pH 7,5 a 25 °C) Tampón de almacenamiento Tris-HCl 50 mM NaCl 250 mM TCEP 1 mM EDTA 1 mM Glicerol al 50 % pH 7,5 a 25 °C Inactivación por calor 65 °C durante 10 minutos Peso molecular aparente: 28 kDa Condiciones del ensayo unitario Se incuban diluciones dobles de proteasa TEV con 2 μg de MBP5-TEV-paramiosina ΔSal y tampón de reacción de proteasa TEV 1X en una reacción de 10 μl. La mezcla de reacción se incuba a 30 °C durante 1 hora. La separación de los productos de reacción se visualiza mediante SDS-PAGE. Preguntas frecuentes : P: ¿Puede la proteasa TEV reconocer y escindir una secuencia distinta a Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-(Gly/Ser)? R: La secuencia de reconocimiento de la proteasa TEV con mayor eficiencia catalítica es ENLYFQ▼S. Sin embargo, el aminoácido en la posición P1' también puede ser G, A, M, C o H (1). Kapust, RB et al. (2002) Biochem. and Biophysical Research Comm. 294, 949-955. P: ¿Es necesario dializar la muestra antes de la escisión con la proteasa TEV? R: Si la muestra de proteína de fusión contiene >2 M de urea, >0,5 M de clorhidrato de guanidina, >50 mM de imidazol, valores de pH inferiores a 6 o superiores a 9, o inhibidores de la cisteína proteasa, será necesario dializar la proteína de fusión antes de la escisión con la proteasa TEV. P: ¿Se puede utilizar la proteasa TEV a temperaturas inferiores? R: Sí, la proteasa TEV se puede utilizar a temperaturas inferiores a 30 °C. La escisión a temperaturas inferiores, como 4 °C, requiere incubación durante la noche. P: ¿Es la proteasa TEV compatible con los inhibidores de la proteasa? R: La actividad de la proteasa TEV no se ve afectada por los siguientes inhibidores de la proteasa: aprotinina, benzamidina, leupeptina, pepstatina y PMSF. P: ¿Es la proteasa TEV compatible con diferentes tampones de reacción? R: Un tampón de reacción óptimo es el tampón de reacción de proteasa TEV 10X suministrado (Tris-HCl 0,5 M, pH 7,5, EDTA 5 mM, DTT 10 mM). Sin embargo, la enzima también es activa en tampones HEPES, fosfato de potasio y acetato de sodio con pH entre 6 y 9. P: ¿Se puede eliminar la proteasa TEV de la reacción tras la escisión? R: Sí, la proteasa TEV contiene una etiqueta de polihistidina en su extremo N-terminal. Tras la escisión de la proteína de fusión, se debe eliminar la proteasa TEV de la reacción de escisión mediante cromatografía de afinidad con metales inmovilizados.