New England Biolabs, P8113L, proteasa α-lítica

La proteasa α-lítica (aLP) escinde después de los residuos de treonina (T), alanina (A), serina (S) y valina (V). Su especificidad la convierte en una proteasa ortogonal y alternativa a otras comúnmente utilizadas en aplicaciones proteómicas, incluidas la tripsina y la quimotripsina. Categorías relacionadas Proteasas, Aplicaciones de análisis del proteoma Herramientas de análisis de proteínas, Digestión de proteínas, Especificación proteómica Tampón de almacenamiento Acetato de sodio 10 mM pH 5 a 25 °C Inactivación por calor 95 °C Peso molecular aparente: 19860 daltons Preguntas frecuentes P: ¿Qué tampones de reacción se recomiendan para usar con la proteasa α-lítica? R: La proteasa α-lítica es activa en una variedad de tampones que incluyen bicarbonato de amonio, Tris-HCl y HEPES. El rango de pH óptimo para la digestión con proteasa α-lítica es de 7,5 a 8,5. Para el análisis espectrométrico de masas posterior, se recomienda el tampón de bicarbonato de amonio. P: ¿Puedo realizar mi digestión con proteasa α-lítica a temperaturas distintas de 37 °C? R: Sí, la proteasa α-lítica es activa entre 4 °C y 50 °C. Pueden ser necesarios tiempos de incubación más largos para las digestas a temperaturas más bajas. El tiempo de digestión recomendado a 37 °C varía de 1 a 18 horas, dependiendo del sustrato y el grado de digestión deseado. P: ¿Por qué debería usar proteasa α-lítica en lugar de tripsina? R: La proteasa α-lítica puede digerir mejor las proteínas que contienen grandes regiones hidrofóbicas o proteínas asociadas a la membrana en comparación con la tripsina, lo que proporciona una mejor cobertura de la secuencia y permite la identificación de nuevas modificaciones postraduccionales. P: ¿Existe alguna ventaja en tratar mi muestra con proteasa α-lítica y tripsina? R: Sí. La escisión específica de sitio tras los residuos de lisina y arginina por tripsina crea péptidos con carga positiva, pero que podrían ser demasiado grandes para la detección por espectrometría de masas. Realizar una doble digestión del sustrato con tripsina y proteasa α-lítica crea péptidos más pequeños, lo que aumenta la cobertura de la secuencia y la probabilidad de identificar nuevas modificaciones postraduccionales. P: ¿Qué reactivos inhiben la actividad de la proteasa α-lítica? A: La actividad de la proteasa α-lítica se inhibe por: 1.0% de desoxicolato de sodio: ∼60% activo 0.1% de SDS: ~50 activo 1% de SDS: 40% activo 1 M de clorhidrato de guanidina: ∼20% activo 4 M de clorhidrato de guanidina: sin actividad Inhibidores de la serina proteasa, como PMSF: sin actividad P: ¿Qué reactivos estimulan la actividad de la proteasa α-lítica? R: La actividad de la proteasa α-lítica se estimula en hasta 0.1% de desoxicolato de sodio. P: ¿Puede la proteasa α-lítica inactivarse por calor? R: Sí. La proteasa α-lítica puede inactivarse por calor incubándola a 95 °C durante 10 minutos. La incubación a 70 °C elimina solo ~50% de la actividad enzimática.