New England Biolabs, P8115S, NEBExpress® T4 Lisozima

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P: ¿Puedo usar NEBExpress® T4 lisozima para la extracción de ADN o ARN? R: Sí. NEBExpress® T4 lisozima no presenta actividad detectable de endonucleasa, exonucleasa, ARNasa o ADNasa y, por lo tanto, se recomienda para la extracción de ADN y ARN. P: ¿Qué tampones son compatibles con NEBExpress® T4 lisozima? R: NEBExpress® T4 lisozima es compatible con tampones Tris-HCl, HEPES y fosfato de sodio. Tiene un rango de pH óptimo de 7,5 a 8,5 y puede complementarse con <25 mM de NaCl, <2 mM de EDTA, <1 mM de MgCl₂ y Tween 20 o Triton X-100 <2 %. La enzima también es compatible con agentes reductores como DTT, β-mercaptoetanol, TCEP y THP. Para una actividad óptima de la lisozima T4, utilice: 1 µL de lisozima T4 NEBExpress (1 µg de enzima) por 1 mL de células resuspendidas en 50 mM de Tris-HCl pH 7,5, 0,5 mM de EDTA. 0,1 µL de lisozima T4 NEBExpress por 1 mL de células resuspendidas en el reactivo de lisis de E. coli NEBExpress® (NEB n.° P8116S). Tenga en cuenta que ≥ 2 mM de EDTA, > 25 mM de NaCl y > 1 mM de MgCl₂ comenzarán a inhibir la actividad enzimática, con una pérdida de actividad del 50 % con 5 mM de EDTA, del 80 % con 50 mM de NaCl y del 80 % con 5 mM de MgCl₂. P: ¿Se pueden utilizar agentes reductores durante la lisis con NEBExpress® T4 Lysozyme? R: Sí, NEBExpress® T4 Lysozyme es compatible con los reactivos reductores de uso común, como β-mercaptoetanol, DTT, TCEP y THP. Para la purificación posterior, a diferencia de otros proveedores, las columnas de centrifugación de níquel NEBExpress® (NEB n.° S1427) y la resina de níquel NEBExpress® (NEB n.° S1428) son químicamente resistentes a estos reactivos reductores. P: ¿Es correcto diluir la lisozima NEBExpress® T4 antes de añadirla a mis células resuspendidas? R: Sí. Si se necesita usar un volumen muy pequeño de lisozima NEBExpress® T4, se puede diluir en Tris-HCl 50 mM a pH 7,5. P: ¿Cuál es la temperatura y el tiempo de incubación óptimos para lisar las células con la lisozima NEBExpress® T4? R: Las células deben lisarse con lisozima T4 a temperatura ambiente o a 4 °C durante 5-10 minutos con agitación suave. No se recomienda la incubación a 37 °C para evitar la posible inducción de la actividad de las proteasas. P: ¿Es la lisozima NEBExpress® T4 activa en otros organismos además de E. coli? R: Sí, NEBExpress® T4 Lysozyme puede lisar eficazmente otras bacterias gramnegativas como Vibrio natriegens, Salmonella typhimurium, Pseudomonas putida, Xanthomonas malvacearum, Ralstonia eutropha, Flavobacterium johnsoniae, así como todas las cepas de expresión de E. coli disponibles en el catálogo de NEB. También es activa en algunas bacterias grampositivas como ciertas cepas de Bacillus (p. ej., B. subtilis, B. thuringiensis). Tenga en cuenta que puede requerirse de 5 a 15 veces más NEBExpress T4 Lysozyme para lograr la lisis con una cepa que no sea E. coli. P: Después de la incubación con NEBExpress® T4 Lysozyme, el lisado se volvió viscoso; ¿cómo puedo solucionar esto? R: Un lisado viscoso resulta de una gran cantidad de ADN liberado. Para reducir la viscosidad, hay tres opciones disponibles: cizallar el ADN sometiendo el lisado a un par de pulsos en un sonicador. Agregar 1 mM de CaCl2 y 1 µL de Nucleasa Micrococcal (NEB #M0247S) por 1 mL de lisado, mezclar e incubar durante 5 minutos a temperatura ambiente. Agregar 1 µL de DNasa I (NEB #M0303S) por 1 mL de lisado y 1 mM de CaCl2 o 1 mM de MgCl2 (especialmente si la suspensión contiene EDTA), mezclar e incubar durante 5 minutos a temperatura ambiente. La DNasa I de NEB está marcada con proteína de unión a maltosa (MBP), lo que hace que su eliminación a través de resina de amilosa (NEB #E8021), resina de amilosa de alto flujo (NEB #E8022) o perlas magnéticas de amilosa (NEB #E8035) sea simple y efectiva. P: ¿Deben congelarse los pellets celulares antes de la lisis con NEBExpress® T4 Lysozyme? R: No es necesario congelarlos; sin embargo, la congelación de los pellets celulares puede aumentar la eficiencia de la lisis. P: ¿Puedo usar NEBExpress® T4 Lysozyme en un ensayo estándar de actividad de lisozima con un sustrato fluorescente (4-metilumbeliferona)? R: No. NEBExpress T4 Lysozyme hidroliza únicamente el sustrato polisacárido, compuesto por una cadena de N-acetilglucosamina (GlcNAc) y ácido N-acetilmurámico (MurNAc) unida en β-1 → 4, al reticularse con una cadena pentapeptídica. El sustrato polisacárido lineal sin los péptidos no es un sustrato para NEBExpress T4 Lysozyme. P: ¿NEBExpress T4 Lysozyme está marcada? R: No. Esta enzima no está marcada. Sin embargo, debido a su alto pI (9,576), se elimina fácilmente mediante resina de intercambio catiónico.