New England Biolabs, P8116L, reactivo de lisis de E. coli NEBExpress®

Categorías relacionadas con NEBExpress: Aplicaciones de células competentes, soluciones de clonación y automatización de alto rendimiento, Expresión de proteínas en E. coli, Preguntas frecuentes sobre expresión de proteínas. P: ¿Cuánto reactivo de lisis de E. coli NEBExpress® debo usar? R: Recomendamos usar 5 ml de reactivo de lisis de E. coli NEBExpress por gramo de células. Alternativamente, el volumen del reactivo de lisis se puede calcular en función del número de unidades de DO600 (UOD600) recolectadas, donde UOD600 es la DO600 de un cultivo multiplicada por su volumen total. Por ejemplo, si se recolecta un cultivo de 5 ml cuando la DO600 es 1,0, 5 ml x 1,0 = 5 UOD600. Se recomienda usar 0,025-0,075 mL de reactivo de lisis por cada 1 UOD600 cosechada, por lo que en el ejemplo anterior se requerirían 0,125 – 0,375 mL. P: ¿Por qué veo precipitación en el reactivo de lisis NEBExpress® E. coli? R: El uso y/o almacenamiento del reactivo de lisis a temperaturas < 4 °C puede causar que los detergentes precipiten. Para disolver los precipitados, simplemente deje que el reactivo alcance la temperatura ambiente y mezcle. P: ¿Puedo usar el reactivo de lisis NEBExpress® E. coli que ha sido congelado? R: Sí, deje que alcance la temperatura ambiente y mezcle. P: ¿Debo enfriar el reactivo de lisis NEBExpress® E. coli antes de usarlo? R: No, la extracción de proteínas es más eficiente cuando el reactivo está entre 15 y 30 °C (temperatura ambiente). Enfriar el reactivo antes de usarlo hará que los detergentes precipiten, lo que resultará en una extracción de proteínas incompleta. P: ¿Debo congelar los pellets celulares antes de lisarlos con el reactivo de lisis de E. coli NEBExpress®? R: La congelación no es necesaria; sin embargo, los pellets celulares congelados pueden resultar en una mayor eficiencia de extracción de proteínas. P: ¿Qué tampón contiene el reactivo de lisis de E. coli NEBExpress®? R: El reactivo de lisis de E. coli NEBExpress es un reactivo Tris de pH 7,5. P: ¿Puedo complementar el reactivo de lisis de E. coli NEBExpress® con NaCl? R: Sí, el reactivo de lisis de E. coli NEBExpress® es compatible con concentraciones de NaCl ≤ 1 M. Concentraciones superiores causarán precipitación. Sin embargo, si se utiliza en presencia de la lisozima T4 NEBExpress® (NEB n.° P8115), la concentración de NaCl debe mantenerse ≤ 25 mM. Si se utiliza en presencia de nucleasa microcócica (NEB n.° M0247S) o DNasa I (NEB n.° M0303), la concentración de NaCl debe mantenerse ≤100 mM. Si se requiere una concentración de NaCl mayor, esta debe ajustarse después de realizar la lisis. P: ¿Puedo cambiar el pH del reactivo de lisis de E. coli NEBExpress®? R: Sí, puede usar un tampón a base de Tris, PIPPS o fosfato para ajustar el pH entre 5,5 y 10. Un pH inferior a 5,5 provocará la precipitación de los componentes del reactivo. P: ¿Es compatible el reactivo de lisis de E. coli NEBExpress® con EDTA? R: Sí, para evitar interferencias con resinas de afinidad metálica, utilice EDTA <0,1 mM. Si se utiliza la resina de Ni NEBExpress (NEB #S1428S) o las columnas de centrifugación de Ni (NEB #S1427S/L), no es necesario considerar la concentración de EDTA, ya que la resina de estos productos es químicamente resistente a la quelación con EDTA. Si se utiliza NEBExpress® T4 Lysozyme (NEB #P8115) junto con el reactivo de lisis de E. coli NEBExpress®, se recomienda usar <2 mM de EDTA. P: ¿Puedo añadir un inhibidor de proteasa a la reacción del reactivo de lisis de E. coli NEBExpress®? R: Sí, pero elija un inhibidor de proteasa compatible con el procesamiento posterior necesario de la proteína de interés. Si se utiliza factor Xa (NEB #P8010), enteroquinasa (NEB #P8070) o trombina, evite usar inhibidores de serina proteasa. Si se utiliza proteasa TEV (NEB n.° P8112), evite el uso de inhibidores de la cisteína proteasa. Si se utilizan enzimas o proteasas dependientes de metales, evite el EDTA/EGTA. P: ¿Necesito añadir lisozima para facilitar la lisis? R: Aunque no siempre es necesario, la adición de lisozima mejorará la eficiencia de la extracción. Añada 1 µL de lisozima NEBExpress® T4 (NEB n.° P8115) por cada 1 mL de lisado. El lisado puede volverse viscoso y requerir la adición de 200-2000 U/mL de nucleasa microcócica (NEB n.° M0247S) o 10-100 U/mL de DNasa I (NEB n.° M0303) en presencia de 1 mM de CaCl₂. P: Mi lisado es viscoso; ¿cómo puedo solucionarlo? R: Un lisado viscoso resulta de la abundante liberación de ADN por el reactivo de lisis. Añada 200-2000 U/mL de nucleasa microcócica (NEB n.° M0247S) o 10-100 U/mL de DNasa I (NEB n.° M0303) en presencia de 1 mM de CaCl₂. Se recomienda realizar una prueba de lisis a pequeña escala con el reactivo de lisis para determinar si se necesita nucleasa microcócica o DNasa I, seguida de una ampliación. La DNasa I de NEB está fusionada a la proteína de unión a maltosa (MBP), lo que facilita y hace más efectiva su eliminación mediante resina de amilosa (NEB n.° E8021), resina de amilosa de alto flujo (NEB n.° E8022) o perlas magnéticas de amilosa (NEB n.° E8035). P: ¿Puedo usar un agente reductor con el reactivo de lisis de E. coli NEBExpress®? R: Sí, el reactivo de lisis de E. coli NEBExpress es compatible con todos los reactivos reductores de uso común, como β-mercaptoetanol, DTT, TCEP y THP. Para la purificación posterior, las columnas de centrifugación de Ni NEBExpress® (NEB n.° S1427) y la resina de Ni NEBExpress (NEB n.° S1428) son químicamente resistentes a estos reactivos reductores; las resinas de afinidad metálica inmovilizadas (p. ej., níquel o cobalto) de otros proveedores podrían no serlo, por lo que debe consultar con el proveedor y elegir un agente reductor adecuado. P: ¿El reactivo de lisis de E. coli NEBExpress® lisa células bacterianas grampositivas o células de levadura? R: El reactivo de lisis de E. coli NEBExpress® lisa algunas bacterias grampositivas, como ciertas cepas de Bacillus (B. subtilis, B. thuringiensis). Se recomienda encarecidamente la adición de NEBExpress® T4 Lysozyme (NEB #P8115) y Micrococcal Nuclease (NEB #M0247S) para obtener una lisis óptima de bacterias grampositivas. El reactivo de lisis de E. coli NEBExpress® tiene una actividad limitada en células de levadura. P: ¿El reactivo de lisis de E. coli NEBExpress® lisa células bacterianas gramnegativas? R: Sí, hemos probado y confirmado la lisis de las siguientes bacterias gramnegativas: Vibrio natriegens, Salmonella typhimurium, Pseudomonas putida, Xanthomonas malvacearum, Ralstonia eutropha, Flavobacterium johnsoniae y todas las cepas de expresión de E. coli disponibles en el catálogo de NEB. P: Mi proteína forma cuerpos de inclusión. ¿Puedo seguir usando este reactivo para lisar mis células? R: Sí, y el reactivo de lisis de E. coli NEBExpress® ayudará a eliminar los cuerpos de inclusión. P: ¿Puedo añadir el reactivo de lisis de E. coli NEBExpress® directamente a mi cultivo celular para lisar las células? R: Sí, recomendamos usar una proporción 1:1 de reactivo de lisis por cultivo celular o por células lavadas y concentradas en el tampón deseado, siempre que este sea compatible con los pasos posteriores. También se pueden añadir NEBExpress® T4 Lisozima (NEB n.° P8115) y Nucleasa Micrococal (NEB n.° M0247S) si es necesario.