New England Biolabs, P8119S, Trypsin-ultra™, grado de espectrometría de masas (recombinante)

Trypsin-ultra, Mass Spectrometry Grade (Recombinant) es una serina proteasa expresada de forma recombinante en Categorías relacionadas Proteasas,, Aplicaciones de análisis de proteomas Herramientas de análisis de proteínas,, Glicobiología y proteómica,, Especificación de análisis de glicoproteínas Condiciones de reacción Tampón de elección, pH 7-9 Relación tripsina:sustrato de 1:10 a 1:200 Incubar a 37 °C Peso molecular Aparente: 22,6 kDa Preguntas frecuentes P: ¿Cuál es la diferencia entre Trypsin-ultra™, Mass Spectrometry Grade (Recombinant) (NEB #P8119), y Trypsin-ultra, Mass Spectrometry Grade (NEB #P8101)? R: Trypsin-ultra, Mass Spectrometry Grade (Recombinant) (NEB #P8119) es tripsina porcina expresada de forma recombinante fabricada sin el uso de ningún componente derivado de animales. Se mutageniza y se modifica químicamente mediante metilación para que la enzima sea excepcionalmente resistente a la autólisis. Por el contrario, la tripsina-ultra, grado de espectrometría de masas (NEB n.° P8101), se aísla y purifica a partir de páncreas bovino, se trata con TPCK para inactivar la actividad de la quimotripsina copurificada y se acetila adicionalmente para reducir la autólisis. Al estar clonada y expresada en E. coli, la tripsina-ultra, grado de espectrometría de masas (recombinante), está naturalmente libre de quimotripsina contaminante y presenta una mayor resistencia a la autólisis. Estas propiedades mejoran la calidad del cromatograma y los datos de espectrometría de masas, lo que resulta en una cuantificación e identificación de péptidos de alta fiabilidad. La tripsina-ultra, grado de espectrometría de masas (recombinante), se presenta en un formato liofilizado fácil de usar y es estable durante 24 meses. P: ¿Cuáles son las ventajas de la tripsina recombinante (NEB n.° P8119)? R: La pureza y la ausencia de actividad proteasa contaminante son cruciales para la calidad de los datos de mapeo de péptidos y experimentos de proteómica ascendente. La tripsina generalmente proviene de fuentes animales, como el páncreas porcino. Otras proteasas digestivas, como la quimotripsina, suelen copurificarse junto con la tripsina. Trypsin-ultra™, Grado para Espectrometría de Masas (Recombinante), está inherentemente libre de contaminación. Además, al estar diseñada para reducir la autólisis, los péptidos derivados de la tripsina están ausentes en los espectros. En conjunto, su pureza y resistencia a la autólisis resultan en una proteólisis específica, una menor complejidad de los espectros y una identificación y cuantificación de proteínas más confiable, mejorando así el análisis y la generación de informes de datos en un entorno regulado. P: ¿Por qué es importante la resistencia a la autólisis? ¿Cuáles son las características que hacen que Trypsin-ultra™, Grado para Espectrometría de Masas (Recombinante) (NEB #P8119) sea resistente a la autólisis? R: La autólisis de la tripsina puede producir varios resultados indeseables. En primer lugar, la autólisis reduce la actividad de la tripsina, lo que provoca una digestión incompleta y la omisión de escisiones. En segundo lugar, un producto intermedio de la autólisis, la ψ-tripsina, presenta una especificidad reducida y escinde aminoácidos distintos de la lisina y la arginina, exhibiendo una actividad similar a la de la quimotripsina. En tercer lugar, la autólisis también puede dificultar la alicuotación, el almacenamiento y la manipulación de la tripsina. La tripsina recombinante está diseñada para conservar sus propiedades enzimáticas y se metila adicionalmente para que sea excepcionalmente resistente a la autólisis. Esto se traduce en una mejor calidad de los datos, estabilidad enzimática y fácil manipulación. P: ¿Cómo debo alicuotar y almacenar Trypsin-ultra™, Grado para Espectrometría de Masas (Recombinante) (NEB n.° P8119)? R: Para una estabilidad óptima a largo plazo, reconstituya Trypsin-ultra, recombinante, grado para espectrometría de masas (recombinante) con agua de alta pureza a una concentración de 0,1 a 1 µg/µL, según sea necesario, y almacene la solución madre a -20 °C hasta por 6 meses. La actividad enzimática se puede conservar durante cinco ciclos de congelación-descongelación. P: ¿Qué tampón de reacción se puede utilizar para la digestión con tripsina? R: La tripsina es compatible con muchos tipos de tampones, con un pH óptimo entre 8 y 9. Los tampones de reacción típicos son Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, o bicarbonato de amonio 50 mM, pH 7,8. Los iones de calcio, aunque no son necesarios para su actividad, pueden estabilizar la tripsina, especialmente en condiciones de digestión prolongada. Se suele utilizar una concentración de 1 a 10 mM. La selección del tampón de digestión también depende de cómo se recolecte o prepare la muestra de proteína y de si la digestión se realiza inmediatamente después del análisis por espectrometría de masas. Generalmente, el tampón de bicarbonato de amonio se considera el sistema tampón más adecuado para la espectrometría de masas, ya que tanto los aniones como los cationes son volátiles. P: ¿Cuál es la proporción óptima de tripsina:proteína para la digestión? R: La proporción tripsina:proteína suele estar entre 1:20 y 1:100, siendo 1:50 la comúnmente recomendada, lo que resulta en una digestión eficiente sin una autólisis excesiva de tripsina. Esta proporción suele depender de factores como la naturaleza y el origen de la muestra de proteína, el uso de un tampón óptimo y la temperatura de incubación. Al utilizar Trypsin-ultra™, grado para espectrometría de masas (recombinante) (NEB n.° P8119) para flujos de trabajo rápidos o de alto rendimiento, hemos utilizado proporciones de 1:5 o 1:10 (sin artefactos observables), lo que permite realizar la digestión en 30 minutos a 37 °C. P: ¿Es la tripsina compatible con detergentes? R: Los detergentes y altas concentraciones de agentes caotrópicos, como SDS, urea y clorhidrato de guanidina, se utilizan con frecuencia para desnaturalizar muestras de proteínas antes del tratamiento con proteasas. Sin embargo, altas concentraciones de agentes caotrópicos y detergentes iónicos (como SDS > 0,1%) inhiben la tripsina. Las muestras desnaturalizadas deben intercambiarse con el tampón o dializarse en un tampón de reacción de tripsina adecuado antes de añadirla para la digestión. Algunos detergentes no iónicos, como NP-40 y Triton, pueden ser compatibles con la digestión con tripsina a bajas concentraciones, pero deben eliminarse de la muestra antes del análisis por espectrometría de masas. P: ¿A qué temperatura se debe realizar la digestión con tripsina? R: La digestión con tripsina se realiza generalmente a 37 °C, pero las reacciones con tripsina pueden incubarse a temperaturas elevadas (50 a 70 °C) para una proteólisis más rápida. En este caso, se debe considerar la termoestabilidad de la muestra de proteína y sus modificaciones postraduccionales (es decir, el aumento de la tasa de desamidación de la asparagina). P: ¿Cómo desalino los péptidos después de la digestión con tripsina? R: Después de la digestión con tripsina y antes del análisis espectrométrico de masas, las muestras de péptidos se pueden limpiar para eliminar los contaminantes que interfieren con la espectrometría de masas. Esto se puede lograr utilizando columnas de exclusión por tamaño, columnas de centrifugación de extracción en fase sólida (SPE) o cartuchos. P: ¿Se pueden utilizar otras proteasas junto con la tripsina? R: Las digestiones dobles con proteasa, realizadas de forma secuencial o simultánea, a veces se utilizan para mejorar la escisión específica del sitio o para lograr la cobertura máxima de las secuencias de proteínas. La otra proteasa puede ser complementaria (p. ej., Endoproteinasa GluC, NEB n.º P8100, o α-Lytic Protease, NEB n.º P8113) o suplementaria (p. ej., Endoproteinasa LysC, NEB n.º P8109).