Laboratorios biológicos de Nueva Inglaterra, R0101L, EcoRI

EcoRI ha sido reformulado con albúmina recombinante (rAlbúmina) a partir del lote n.º 10227213. Categorías relacionadas Endonucleasas de restricción CG,, Enzimas de restricción calificadas que ahorran tiempo Aplicaciones Clonación rápida: acelere sus flujos de trabajo de clonación con reactivos de NEB,, Especificación de digestión con enzimas de restricción Definición de unidad Una unidad se define como la cantidad de enzima necesaria para digerir 1 µg de ADN λ en 1 hora a 37 °C en un volumen de reacción total de 50 μl. Condiciones de reacción 1X NEBuffer™ EcoRI/SspI Incubar a 37 °C 1X NEBuffer™ EcoRI/SspI 100 mM Tris-HCl 50 mM NaCl 10 mM MgCl2 0,025 % Triton® X-100 (pH 7,5 a 25 °C) Actividad en NEBuffers NEBuffer™ r1.1: 25 % NEBuffer™ r2.1: 100 % NEBuffer™ r3.1: 50 % Tampón rCutSmart™: 50 % Compatibilidad del diluyente Diluyente C Tampón de almacenamiento 10 mM KPO4 300 mM NaCl 0,1 mM EDTA 200 µg/ml Albúmina recombinante 50 % Glicerol 1 mM DTT 0,15 % Triton® X-100 pH 7 a 25 °C Inactivación por calor 65 °C durante 20 minutos Sensibilidad a la metilación dam metilación: No sensible metilación dcm: No sensible Metilación CpG: Bloqueada por algunas combinaciones de solapamiento Preguntas frecuentes P: ¿Qué es la actividad estrella y cómo se puede evitar? R: Se ha demostrado que en condiciones extremas no estándar, las endonucleasas de restricción son capaces de escindir secuencias que son similares pero no idénticas a su secuencia de reconocimiento definida. Esta especificidad alterada o relajada se ha denominado actividad "estrella". Se ha sugerido que la actividad estrella puede ser una propiedad general de las endonucleasas de restricción y que cualquier endonucleasa de restricción puede ser capaz de escindir sitios no canónicos en ciertas condiciones extremas. La manera en que se altera la especificidad de una enzima depende de la enzima y de las condiciones empleadas para inducir la actividad estrella. Los tipos más comunes de actividad alterada son las sustituciones de bases individuales, el truncamiento de las bases externas en la secuencia de reconocimiento y el corte de cadenas simples. La actividad estrella es completamente controlable en la gran mayoría de los casos y generalmente no representa un problema al realizar digestores con endonucleasas de restricción. Las enzimas de New England Biolabs no presentan actividad estrella cuando se utilizan en las condiciones recomendadas en los NEBuffers suministrados. A continuación, se enumeran las condiciones de reacción que se sabe que inducen o inhiben la actividad estrella. Condiciones que contribuyen a la actividad estelar 1. Alta concentración de glicerol [> 5% v/v] 2. Alta proporción de unidades a µg de ADN [varía con cada enzima, normalmente >100 unidades/µg] 3. Baja fuerza iónica [< 25 mM] 4. pH alto [> pH 8,0] 5. Presencia de disolventes orgánicos [DMSO, etanol, etilenglicol, dimetilacetamida, dimetilformamida, sulfalano] 6. Sustitución de Mg++ por otros cationes divalentes [Mn++, Cu++, Co++, Zn++] Inhibición de la actividad estelar Si le preocupa la actividad estelar, le recomendamos las siguientes directrices. 1. Utilice la menor cantidad de unidades posible para obtener una digestión completa. Esto evita la sobredigestión y reduce la concentración final de glicerol en la reacción. 2. Asegúrese de que la reacción esté libre de disolventes orgánicos, como alcoholes, que podrían estar presentes en la preparación de ADN. 3. Aumente la fuerza iónica del tampón de reacción a 100-150 mM (siempre que la enzima no se vea inhibida por un alto contenido de sal). 4. Disminuya el pH del tampón de reacción a pH 7,0. 5. Utilice Mg++ como catión divalente. P: ¿Tengo que configurar las digestiones con enzimas cualificadas Time-Saver™ durante 5-15 minutos? ¿Puedo digerir durante más tiempo? R: Las enzimas Time-Saver™ de NEB tienen la ventaja de trabajar rápido (5-15 minutos), pero también están diseñadas y cualificadas para soportar digestiones durante la noche sin degradación del ADN. P: ¿Qué enzimas de restricción de NEB se suministran con Gel Loading Dye, Purple (6X)? R: Todas las enzimas de restricción HF y la mayoría de las enzimas de restricción NEB no HF se suministran con Gel Loading Dye, Purple (6X). Las enzimas de restricción no HF que vienen suministradas con el tinte púrpura son: AatII AsiSI BsmBI-v2 EagI MboI NlaIII PvuI SmaI Acil AvrII BspHI EcoRI MboII NotI RsaI SpeI AfeI BamHI BsrGI EcoRV MluI NspI SacI StuI AflII BbsI ClaI Esp3I FseI MseI PacI SacII AgeI BglII DdeI HaeIII MspI PciI SalI XbaI AluI BsaI DpnI HindIII NcoI PmeI SapI XhoI ApaI BseYI DpnII HpaI NdeI PsiI-v2 SfaNI XmaI ApeKI BsiWI DraI KpnI NheI PstI SfiI XmnI AscI * Todas las enzimas de restricción HF también se suministran con tinte de carga en gel, morado (6X) P: ¿Esta enzima es sensible a ¿Metilación de CpG en dam, dcm o mamíferos? R: Sí. Esta enzima no puede cortar los sitios de reconocimiento en el ADN genómico de mamíferos que están bloqueados por algunas combinaciones de metilación de CpG superpuesta. Para obtener información actualizada sobre la sensibilidad a la metilación, visite Dam-Dcm y Metilación de CpG o REBASE.