Laboratorios biológicos de Nueva Inglaterra, R0105S, HpaI

HpaI se ha reformulado con albúmina recombinante (rAlbúmina) a partir del lote n.º 10128074. Categorías relacionadas Endonucleasas de restricción Aplicaciones de HM Digestión con enzimas de restricción Unidad de especificación Definición Una unidad se define como la cantidad de enzima necesaria para digerir 1 µg de ADN λ en 1 hora a 37 °C en un volumen de reacción total de 50 μl. Condiciones de reacción Tampón rCutSmart™ 1X Incubar a 37 °C Tampón rCutSmart™ 1X Acetato de potasio 50 mM Tris-acetato 20 mM Acetato de magnesio 10 mM Albúmina recombinante 100 µg/ml (pH 7,9 a 25 °C) Actividad en tampones NE Tampón NE™ r1.1: <10 % Tampón NE™ r2.1: 75 % Tampón NE™ r3.1: 25 % Tampón rCutSmart™: 100 % Compatibilidad del diluyente Diluyente A Tampón de almacenamiento Tris-HCl 10 mM KCl 50 mM DTT 1 mM EDTA 0,1 mM 200 µg/ml Albúmina recombinante 50 % Glicerol pH 7,4 a 25 °C Inactivación por calor Sin sensibilidad a la metilación Metilación de la presa: no sensible Metilación de dcm: no sensible Metilación de CpG: bloqueada por algunas combinaciones de superposición Preguntas frecuentes P: ¿Cuándo es la actividad estrella un problema para HpaI? R: Las condiciones de alta concentración de enzima, concentración de glicerol mayor del 5% o pH mayor de 8,0 pueden resultar en actividad estrella. P: ¿Qué sabemos sobre la actividad estrella con HpaI? R: La actividad estrella de HpaI se puede detectar con 10 unidades de enzima en un μg de ADN lambda después de 16 horas. P: ¿Cómo recomienda usar HpaI? R: No diluya por debajo de la concentración de venta. P: ¿Una cierta sal o nivel de sal inhibe la actividad de HpaI? R: Algunos datos sugieren que las concentraciones de sal mayores de 10 mM pueden inhibir la actividad de HpaI. (Krotee, S., observación no publicada) Por lo tanto, el ADN de minipreparación que contiene sal residual puede ser resistente a la escisión de HpaI. Se recomienda un lavado con etanol al 70 % o diálisis para eliminar la sal. Al realizar precipitaciones con etanol, se recomienda usar acetato de potasio, si es necesario, en lugar de acetato de amonio o de sodio, debido a la posible inhibición de la actividad de HpaI. P: ¿Aumenta la espermidina la actividad de HpaI? R: La espermidina en concentraciones de 0,5 a 2,0 mM inhibe la actividad de HpaI. (REBASE ref.# 1288. Kuosmanen, M., Poso, H. FEBS Lett. 179: 17-20 (1985). P: ¿El dUTP incorporado en el sitio inhibe la HpaI? R: Sí. REBASE Ref.# 551. Dwyer, PA, Riftina, F., Agarwal, KL Fed. Proc. 38:294 (1979). P: ¿La HpaI es activa a 25 °C? R: La HpaI tiene una actividad del 50-75 % a 25 °C. P: ¿Cuál es el peso molecular de la HpaI? R: 30 kD, determinado a partir de los datos de la secuencia. P: Probé su enzima de restricción en el ADN sustrato recomendado por NEB y parece estar activo; sin embargo, no digiere mi ADN. ¿Cuál podría ser la razón? R: La calidad y la limpieza del ADN son factores importantes que pueden afectar la actividad enzimática. Enzimas de restricción activas en El tampón rCutSmart®, aunque no es tan activo en NEBuffer r2.1 o r3.1 (nuestros tampones con mayor concentración de sal), puede ser inhibido por la sal presente en la reacción. Los procedimientos de purificación de ADN que utilizan columnas de centrifugación pueden generar soluciones de ADN con niveles significativos de sal que pueden transferirse a la reacción e inhibir la actividad enzimática. Para evitar esto, recomendamos que la solución de ADN añadida a la reacción no supere el 25 % del volumen total de reacción. Esto se puede lograr ajustando el volumen total de reacción según corresponda. P: ¿Qué es la actividad estrella y cómo se puede evitar? R: Se ha demostrado que, en condiciones extremas no estándar, las endonucleasas de restricción son capaces de escindir secuencias similares, pero no idénticas, a su secuencia de reconocimiento definida. Esta especificidad alterada o relajada se ha denominado actividad "estrella". Se ha sugerido que la actividad estrella puede ser una propiedad general de las endonucleasas de restricción y que cualquier endonucleasa de restricción puede escindir sitios no canónicos en ciertas condiciones extremas. La forma en que se determina la especificidad de una enzima... La alteración depende de la enzima y de las condiciones empleadas para inducir la actividad estrella. Los tipos más comunes de actividad alterada son las sustituciones de bases individuales, el truncamiento de las bases externas en la secuencia de reconocimiento y el corte de hebras simples. La actividad estrella es completamente controlable en la gran mayoría de los casos y generalmente no es un problema al realizar digestores con endonucleasas de restricción. Las enzimas de New England Biolabs no exhibirán actividad estrella cuando se utilicen en las condiciones recomendadas en los NEBuffers suministrados. A continuación, se enumeran las condiciones de reacción que se sabe que inducen o inhiben la actividad estrella. Condiciones que contribuyen a la actividad estrella: 1. Alta concentración de glicerol [> 5 % v/v] 2. Alta proporción de unidades a µg de ADN [varía con cada enzima, generalmente > 100 unidades/µg] 3. Baja fuerza iónica [< 25 mM] 4. pH alto [> pH 8,0] 5. Presencia de disolventes orgánicos [DMSO, etanol, etilenglicol, dimetilacetamida, dimetilformamida, sulfalano] 6. Sustitución de Mg++ con otros cationes divalentes [Mn++, Cu++, Co++, Zn++] Inhibición de la actividad estelar. Si le preocupa la actividad estelar, le recomendamos las siguientes pautas: 1. Utilice la menor cantidad de unidades posible para lograr una digestión completa. Esto evita la sobredigestión y reduce la concentración final de glicerol en la reacción. 2. Asegúrese de que la reacción esté libre de disolventes orgánicos, como alcoholes, que podrían estar presentes en la preparación de ADN. 3. Aumente la fuerza iónica del tampón de reacción a 100-150 mM (siempre que la enzima no se inhiba por un alto contenido de sal). 4. Disminuya el pH del tampón de reacción a pH 7.0. 5. Utilice Mg++ como catión divalente. P: ¿Cómo se puede inactivar esta enzima? R: Para inactivar enzimas que no se pueden eliminar por calor, recomendamos una extracción con fenol seguida de una precipitación con etanol o una columna de centrifugación comercial diseñada para purificar ADN. P: ¿Qué enzimas de restricción NEB se suministran con el colorante de carga de gel púrpura? (6X)? R: Todas las enzimas de restricción HF y la mayoría de las enzimas de restricción NEB no HF se suministran con tinte de carga en gel, morado (6X). Las enzimas de restricción no HF que vienen suministradas con el tinte púrpura son: AatII AsiSI BsmBI-v2 EagI MboI NlaIII PvuI SmaI Acil AvrII BspHI EcoRI MboII NotI RsaI SpeI AfeI BamHI BsrGI EcoRV MluI NspI SacI StuI AflII BbsI ClaI Esp3I FseI MseI PacI SacII AgeI BglII DdeI HaeIII MspI PciI SalI XbaI AluI BsaI DpnI HindIII NcoI PmeI SapI XhoI ApaI BseYI DpnII HpaI NdeI PsiI-v2 SfaNI XmaI ApeKI BsiWI DraI KpnI NheI PstI SfiI XmnI AscI * Todas las enzimas de restricción HF también se suministran con colorante de carga de gel, púrpura (6X). P: ¿Es esta enzima sensible a la metilación de CpG de DAM, DCM o mamíferos? R: Sí. Esta enzima no puede cortar los sitios de reconocimiento en el ADNg de mamíferos que están bloqueados por algunas combinaciones de metilación de CpG superpuesta. Para obtener información actualizada sobre la sensibilidad a la metilación, visite Dam-DCM y metilación de CpG o REBASE. P: ¿Pueden darme más información sobre el cambio de BSA a albúmina recombinante (rAlbúmina) en los tampones NEB? R: NEB se complace en anunciar que hemos cambiado los tampones de reacción que contienen BSA (NEBuffer 1.1, 2.1, 3.1 y CutSmart® Buffer) a tampones que contienen albúmina recombinante (NEBuffer r1.1, r2.1, r3.1 y rCutSmart™ Buffer). También estamos en El proceso de adaptar todas las formulaciones de enzimas de restricción para que contengan albúmina recombinante (rAlbúmina). Consideramos que dejar de usar productos de origen animal es un paso en la dirección correcta y podemos ofrecer esta mejora al mismo precio. P: ¿Se puede almacenar el colorante de carga de gel, púrpura 6X (B7024) a bajas temperaturas? R: La temperatura de almacenamiento recomendada para el colorante de carga de gel, púrpura 6X, es la temperatura ambiente (25 °C). Es común que la SDS precipite la solución cuando el colorante se almacena a bajas temperaturas. Este ligero precipitado se puede disipar dejando el vial a temperatura ambiente durante una hora o calentándolo suavemente durante 10 minutos. Mezcle el vial varias veces antes de usarlo para homogeneizar la solución.