Laboratorios biológicos de Nueva Inglaterra, R0109L, FokI

FokI ha sido reformulado y ahora también incluye albúmina recombinante (rAlbúmina) a partir del lote n.º 10295609. Categorías relacionadas Endonucleasas de restricción Aplicaciones de CG Digestión con enzimas de restricción Unidad de especificación Definición Una unidad se define como la cantidad de enzima necesaria para digerir 1 µg de ADN λ en 1 hora a 37 °C en un volumen de reacción total de 50 μl. Condiciones de reacción Tampón rCutSmart™ 1X Incubar a 37 °C Tampón rCutSmart™ 1X Acetato de potasio 50 mM Tris-acetato 20 mM Acetato de magnesio 10 mM Albúmina recombinante 100 µg/ml (pH 7,9 a 25 °C) Actividad en tampones NE Tampón NE™ r1.1: 100 % Tampón NE™ r2.1: 100 % Tampón NE™ r3.1: 75 % Tampón rCutSmart™: 100 % Compatibilidad del diluyente Diluyente A Tampón de almacenamiento Tris-HCl 10 mM NaCl 50 mM DTT 1 mM EDTA 0,1 mM 200 µg/ml Albúmina recombinante 50 % Glicerol pH 7,4 a 25 °C Inactivación por calor 65 °C durante 20 minutos Sensibilidad a la metilación dam methylation: No sensible dcm methylation: Deteriorada por superposición CpG Metilación: Deteriorada por superposición Preguntas frecuentes P: ¿FokI tiende a degradar el ADN? R: Sí. Use un máximo de 2-3 unidades/μg de ADN durante 1 hora o menos. Se puede agregar Tween 20 a una concentración final del 0,1 % para reducir la degradación. P: ¿Por qué FokI degrada el ADN? R: FokI tiene dos dominios; uno que reconoce el ADN y otro que lo escinde. La proteína es inestable y, a medida que se pierde la actividad específica, resulta en un aumento de la actividad no específica. Tween 20 estabiliza la proteína y ralentiza el aumento de la actividad no específica. P: ¿Se recomienda la digestión prolongada de FokI? R: La digestión prolongada no es beneficiosa porque la enzima no es estable en la reacción y puede degradar el ADN. P: ¿FokI se bloquea por metilación? R: FokI cortará de 2 a 4 veces más lento si el extremo C en la secuencia va seguido de una G y está metilado. Además, FokI no cortará el ADN por completo si hay un sitio de metilación MspI antes del sitio de reconocimiento. Para obtener información actualizada sobre las sensibilidades de metilación, visite Dam-Dcm y metilación CpG o REBASE. P: ¿Se utiliza FokI en técnicas especiales? R: FokI se utiliza para escindir entre dos pares de bases cualesquiera. Véase Podhajska, AJ, Szybalski, W. (1985). Gene 40: 175-182. En resumen, se sintetiza un oligonucleótido que contiene un sitio FokI bicatenario y una extensión monocatenaria que se anela al molde de ADN en el punto donde se desea cortar. Se anela el dúplex de oligonucleótido al molde de ADN monocatenario. En la reacción de escisión posterior, FokI se unirá al sitio bicatenario del dúplex de oligonucleótidos y cortará la plantilla a la que está hibridado. P: ¿Cuál es el peso molecular de FokI? R: 65,6 kD, según los datos de secuencia. P: ¿Es la actividad de FokI sensible al pH? R: El rango de pH óptimo para FokI está entre 7,0 y 8,5. P: ¿Es FokI activo a 25 °C? R: FokI exhibe una actividad del 25-50 % a 25 °C. P: ¿FokI escinde el ADN monocatenario (ssDNA)? R: No. P: ¿Pueden darme más información sobre el cambio de BSA a albúmina recombinante (rAlbúmina) en los NEBuffers? A: NEB se complace en anunciar que hemos cambiado los tampones de reacción con BSA (NEBuffer 1.1, 2.1, 3.1 y CutSmart® Buffer) por tampones con albúmina recombinante (NEBuffer r1.1, r2.1, r3.1 y rCutSmart™ Buffer). También estamos en proceso de adaptar todas las formulaciones de enzimas de restricción para que contengan albúmina recombinante. Creemos que dejar de usar productos con ingredientes de origen animal es un paso en la dirección correcta y podemos ofrecer esta mejora al mismo precio.