Laboratorios biológicos de Nueva Inglaterra, R0114L, ApaI

Nueva temperatura de incubación de 37 °C. Categorías relacionadas Endonucleasas de restricción: A,, Enzimas de restricción calificadas que ahorran tiempo Aplicaciones Clonación rápida: acelere sus flujos de trabajo de clonación con reactivos de NEB,, Definición de unidad de especificación de digestión con enzimas de restricción Una unidad se define como la cantidad de enzima necesaria para digerir 1 µg de ADN pXba en 1 hora a 37 °C en un volumen de reacción total de 50 μl. Condiciones de reacción Tampón rCutSmart™ 1X Incubar a 37 °C Tampón rCutSmart™ 1X Acetato de potasio 50 mM Tris-acetato 20 mM Acetato de magnesio 10 mM Albúmina recombinante 100 µg/ml (pH 7,9 a 25 °C) Actividad en tampones NE Tampón NE™ r1.1: 25 % Tampón NE™ r2.1: 25 % Tampón NE™ r3.1: <10 % Tampón rCutSmart™: 100 % Compatibilidad del diluyente Diluyente A Tampón de almacenamiento Tris-HCl 10 mM KCl 50 mM DTT 1 mM EDTA 0,1 mM 500 µg/ml Albúmina recombinante 50 % Glicerol pH 7,4 a Inactivación por calor a 25 °C 65 °C durante 20 minutos Sensibilidad a la metilación Metilación en dam: no sensible Metilación en dcm: bloqueada por la superposición de CpG Metilación: bloqueada por la superposición Actividad a temperatura a 25 °C: 100 % Preguntas frecuentes P: ¿La actividad de ApaI es sensible a la metilación en dam, dcm o CpG de mamíferos? R: Sí. ApaI no puede cortar sitios de reconocimiento que contengan metilación en dcm superpuesta. ApaI no puede cortar sitios de reconocimiento en gDNA de mamíferos que contengan metilación en CpG superpuesta. Para obtener información actualizada sobre las sensibilidades de metilación, visite REBASE. P: ¿Cuántos pares de bases se deben agregar al final de un cebador de PCR después del sitio de reconocimiento de ApaI para garantizar que ApaI corte correctamente? R: Se recomienda la adición de 6 pares de bases. P: ¿ApaI tiene neoesquizómeros? R: Sí. Bsp120I y PspOMI son neoesquizómeros de ApaI, pero ApaI es la única enzima que produce una extensión 3'. Para obtener la información más actualizada sobre isoesquizómeros/neoesquizómeros, consulte REBASE. P: Parece que ApaI tiene dificultades para cortar mi ADN. ¿Hay alguna razón? R: La actividad de ApaI se ve inhibida por concentraciones de sal superiores a 50 mM. Si el aislamiento de ADN ha dado como resultado una solución de ADN con altos niveles de sal, la enzima podría tener dificultades para cortar ese ADN. P: ¿Tengo que preparar las digestiones con enzimas con certificación Time-Saver™ durante 5-15 minutos? ¿Puedo digerir durante más tiempo? R: Las enzimas Time-Saver™ de NEB tienen la ventaja de actuar rápidamente (5-15 minutos), pero también están diseñadas y certificadas para soportar digestiones nocturnas sin degradar el ADN. P: Probé su enzima de restricción en el ADN sustrato recomendado por NEB y parece estar activa; sin embargo, no digiere mi ADN. ¿Cuál podría ser la razón? R: La calidad y la limpieza del ADN son factores importantes que pueden afectar la actividad enzimática. Las enzimas de restricción activas en el tampón rCutSmart®, pero no tan activas en el tampón NE r2.1 o r3.1 (nuestros tampones con mayor concentración de sal), pueden verse inhibidas por la sal presente en la reacción. Los procedimientos de purificación de ADN que utilizan columnas de centrifugación pueden generar soluciones de ADN con niveles significativos de sal que pueden pasar a la reacción e inhibir la actividad enzimática. Para evitar esto, recomendamos que la solución de ADN añadida a la reacción no supere el 25 % del volumen total de reacción. Esto se puede lograr ajustando el volumen total de reacción según corresponda. P: ¿Qué enzimas de restricción NEB se suministran con el colorante de carga de gel morado (6X)? R: Todas las enzimas de restricción HF y la mayoría de las enzimas de restricción NEB sin HF se suministran con el colorante de carga de gel morado (6X). Las enzimas de restricción no HF que vienen suministradas con el tinte púrpura son: AatII AsiSI BsmBI-v2 EagI MboI NlaIII PvuI SmaI Acil AvrII BspHI EcoRI MboII NotI RsaI SpeI AfeI BamHI BsrGI EcoRV MluI NspI SacI StuI AflII BbsI ClaI Esp3I FseI MseI PacI SacII AgeI BglII DdeI HaeIII MspI PciI SalI XbaI AluI BsaI DpnI HindIII NcoI PmeI SapI XhoI ApaI BseYI DpnII HpaI NdeI PsiI-v2 SfaNI XmaI ApeKI BsiWI DraI KpnI NheI PstI SfiI XmnI AscI * Todas las enzimas de restricción HF también se suministran con tinte de carga en gel, morado (6X) P: ¿Puedes contarme más? ¿Qué opina sobre el cambio de BSA a albúmina recombinante (rAlbúmina) en los tampones NEBuffer? R: NEB se complace en anunciar que hemos cambiado los tampones de reacción con BSA (NEBuffer 1.1, 2.1, 3.1 y CutSmart® Buffer) por tampones con albúmina recombinante (NEBuffer r1.1, r2.1, r3.1 y rCutSmart™ Buffer). También estamos en proceso de cambiar todas las formulaciones de enzimas de restricción para que contengan rAlbúmina. Creemos que dejar de usar productos con ingredientes de origen animal es un paso en la dirección correcta y podemos ofrecer esta mejora al mismo precio. P: Con el objetivo de estandarizar las condiciones de reacción, se ha modificado la temperatura de incubación recomendada para ApaI (NEB n.° R0114), BaeI (NEB n.° R0613), BsrDI (NEB n.° R0574) y SmaI (NEB n.° R0141). ¿Qué temperatura de incubación debo usar? R: Se puede incubar con seguridad a cualquiera de las dos temperaturas. Tenga en cuenta que, para SmaI, recomendamos incubar a 25 °C si se realizan digestiones prolongadas (más de 1 hora). P: ¿Son ciertas enzimas de restricción más activas a temperaturas de incubación más altas que las recomendadas? R: Las enzimas de restricción NEB son 100 % activas a la temperatura de incubación recomendada en el tampón recomendado que se proporciona con cada enzima. Con algunas enzimas de restricción aisladas de especies termófilas, es posible que se observe un aumento de la actividad a temperaturas de incubación más altas. No recomendamos aumentar la temperatura, ya que podrían aparecer actividades nucleasas adicionales a temperaturas no recomendadas.