Laboratorios biológicos de Nueva Inglaterra, R0123S, SfiI

Requiere dos o más sitios de escisión. Revise la lista de enzimas y las recomendaciones en las siguientes categorías relacionadas: Endonucleasas de restricción S, Enzimas de restricción calificadas que ahorran tiempo. Aplicaciones. Especificación de digestión con enzimas de restricción. Definición de unidad: Una unidad se define como la cantidad de enzima necesaria para digerir 1 µg de ADN pXba en 1 hora a 50 °C en un volumen total de reacción de 50 μl. Condiciones de reacción Tampón rCutSmart™ 1X Incubar a 50 °C Tampón rCutSmart™ 1X Acetato de potasio 50 mM Tris-acetato 20 mM Acetato de magnesio 10 mM Albúmina recombinante 100 µg/ml (pH 7,9 a 25 °C) Actividad en tampones NE Tampón NE™ r1.1: 25 % Tampón NE™ r2.1: 100 % Tampón NE™ r3.1: 50 % Tampón rCutSmart™: 100 % Compatibilidad del diluyente Diluyente C Tampón de almacenamiento Tris-HCl 10 mM NaCl 250 mM EDTA 0,1 mM BSA 200 µg/ml Glicerol al 50 % Triton® X-100 al 0,15 % 1 mM DTT pH 7,4 a 25 °C Inactivación por calor Sin sensibilidad a la metilación Metilación en dam: No sensible Metilación en dcm: Deteriorada por la superposición Metilación en CpG: Bloqueada por algunas combinaciones de superposición Actividad a temperatura a 37 °C: 10 % Preguntas frecuentes P: ¿Cuál es la distancia mínima necesaria entre dos sitios SfiI? ¿Pueden seguirse directamente? R: Esta pregunta se puede responder en varios niveles. Si simplemente desea lograr una eficiencia de digestión tan buena como en un vector con un solo sitio SfiI (que es una digestión ineficiente), entonces puede usar una separación de aproximadamente 10 pb. Para una eficiencia óptima de escisión de los dos sitios SfiI, querría incluir un "fragmento de relleno" de al menos 170 pb. [Yo sugeriría 200 pb]. La cinética de SfiI parece ser única entre las enzimas de restricción disponibles comercialmente. Por esta razón, las reacciones de SfiI pueden ser difíciles de optimizar. Un vector con un solo sitio SfiI es probablemente el tipo más difícil si el objetivo es lograr la compleción completa. Tanto la proporción de enzima: ADN (unidades: microgramos) como la concentración de ADN son importantes. Un vector con dos sitios SfiI se corta mucho más rápido, debido a una reacción cooperativa que involucra a ambos sitios, PERO SOLO si ambos sitios están separados por al menos 170 pb (suficiente para permitir la formación de bucles en el ADN). P: ¿Puedo lograr la digestión de un plásmido con un solo sitio SfiI? R: Las reacciones trans se ven facilitadas por el aumento de la concentración de ADN (por lo que se puede lograr la digestión aumentando la concentración de ADN, pero podría no ser eficiente); sin embargo, la reacción SfiI puede verse obstaculizada por el aumento de la concentración de enzima. En reacciones con exceso de enzima en los sitios de ADN, cada sitio se carga con un tetrámero SfiI, lo que impide que la proteína se una a los dos sitios necesarios para una actividad completa. P: ¿Los sitios de reconocimiento degenerados deben ser palindrómicos? R: La mayoría de los sitios de reconocimiento de enzimas de restricción son palindrómicos e incluyen solo pares de bases específicos (es decir, EcoRI reconoce GAATTC). Sin embargo, algunas enzimas tienen sitios degenerados, lo que significa que contienen uno o más pares de bases que no están específicamente definidos (es decir, BsrFI-v2 reconoce RCCGGY, donde R = A o G e Y = C o T). Para enzimas degeneradas, cualquier base representada por el código de una sola letra puede estar presente en cualquier ubicación en el sitio de reconocimiento para que ocurra la escisión. Por ejemplo, BsrFI-v2 reconoce todas las siguientes secuencias: ACCGGC, ACCGGT, GCCGGC, GCCGGT. P: ¿Cómo se puede inactivar esta enzima? R: Para inactivar enzimas que no se pueden matar por calor, recomendamos una extracción con fenol seguida de precipitación con etanol o una columna de centrifugación comercial diseñada para purificar ADN. P: ¿Por qué la enzima no corta completamente? R: Los sustratos con un sitio SfiI se cortan de forma menos eficiente que los sustratos con dos sitios. SfiI existe en solución como tetrámero y parece interactuar con dos copias de su secuencia de reconocimiento antes de poder escindir el ADN. Su reacción principal consiste entonces en cortar ambas cadenas en ambos sitios en un proceso coordinado. Los dos sitios pueden estar en la misma molécula de ADN o en moléculas diferentes. - de Lois M. Wentzell, Timothy J. Nobbs y Stephen E. Halford, Mol. Biol. 248:581-595 (1995). La endonucleasa de restricción SfiI produce una ruptura de cuatro cadenas de ADN en dos copias de su secuencia de reconocimiento. P: ¿Puedo añadir un oligonucleótido a mi reacción para que haya dos sitios disponibles para un corte eficiente? R: Sí. Siempre que haya dos sitios disponibles, no importa si están en la misma molécula de ADN o en moléculas diferentes. P: ¿Tengo que preparar las digestas con enzimas certificadas Time-Saver™ durante 5 a 15 minutos? ¿Puedo digerir durante más tiempo? R: Las enzimas Time-Saver™ de NEB ofrecen la ventaja de actuar rápidamente (5-15 minutos), pero también están diseñadas y certificadas para soportar digestiones nocturnas sin degradar el ADN. P: Probé su enzima de restricción en el ADN sustrato recomendado por NEB y parece estar activa; sin embargo, no digiere mi ADN. ¿Cuál podría ser la razón? R: La calidad y la limpieza del ADN son factores importantes que pueden afectar la actividad enzimática. Las enzimas de restricción activas en el tampón rCutSmart®, pero no tan activas en el tampón NE r2.1 o r3.1 (nuestros tampones con mayor concentración de sal), pueden verse inhibidas por la sal presente en la reacción. Los procedimientos de purificación de ADN que utilizan columnas de centrifugación pueden generar soluciones de ADN con niveles significativos de sal que pueden transferirse a la reacción e inhibir la actividad enzimática. Para evitar esto, recomendamos que la solución de ADN añadida a la reacción no supere el 25 % del volumen total de la reacción. Esto se puede lograr ajustando el volumen total de la reacción según corresponda. P: ¿Qué enzimas de restricción NEB se suministran con el colorante de carga de gel morado (6X)? R: Todas las enzimas de restricción HF y la mayoría de las enzimas de restricción NEB no HF se suministran con el colorante de carga de gel morado (6X). Las enzimas de restricción no HF que vienen suministradas con el tinte púrpura son: AatII AsiSI BsmBI-v2 EagI MboI NlaIII PvuI SmaI Acil AvrII BspHI EcoRI MboII NotI RsaI SpeI AfeI BamHI BsrGI EcoRV MluI NspI SacI StuI AflII BbsI ClaI Esp3I FseI MseI PacI SacII AgeI BglII DdeI HaeIII MspI PciI SalI XbaI AluI BsaI DpnI HindIII NcoI PmeI SapI XhoI ApaI BseYI DpnII HpaI NdeI PsiI-v2 SfaNI XmaI ApeKI BsiWI DraI KpnI NheI PstI SfiI XmnI AscI * Todas las enzimas de restricción HF también se suministran con tinte de carga en gel, morado (6X) P: ¿Esta enzima es sensible a ¿Metilación de dam, dcm o CpG en mamíferos? R: Sí. Esta enzima no puede cortar los sitios de reconocimiento afectados por la metilación superpuesta de dcm o bloqueados por algunas combinaciones de metilación superpuesta de CpG. Para obtener información actualizada sobre la sensibilidad a la metilación, visite Dam-Dcm y metilación de CpG o REBASE. P: ¿Pueden darme más información sobre la transición de BSA a albúmina recombinante (rAlbúmina) en los tampones NEB? R: NEB se complace en anunciar que hemos cambiado los tampones de reacción con BSA (NEBuffer 1.1, 2.1, 3.1 y CutSmart® Buffer) por tampones con albúmina recombinante (NEBuffer r1.1, r2.1, r3.1 y rCutSmart™ Buffer). También estamos en proceso de migrar todas las formulaciones de enzimas de restricción para que contengan rAlbúmina. Creemos que alejarnos de los productos que contienen ingredientes de origen animal es un paso en la dirección correcta y podemos ofrecer esta mejora al mismo precio.