Laboratorios biológicos de Nueva Inglaterra, R0157L, SacII

SacII ha sido reformulado con albúmina recombinante (rAlbúmina) a partir del lote n.º 10180741. Categorías relacionadas Endonucleasas de restricción S,, Enzimas de restricción calificadas que ahorran tiempo Aplicaciones Clonación rápida: acelere sus flujos de trabajo de clonación con reactivos de NEB,, Especificación de digestión con enzimas de restricción Definición de unidad Una unidad se define como la cantidad de enzima necesaria para digerir 1 µg de ADN pXba en 1 hora a 37 °C en un volumen de reacción total de 50 μl. Condiciones de reacción Tampón rCutSmart™ 1X Incubar a 37 °C Tampón rCutSmart™ 1X Acetato de potasio 50 mM Tris-acetato 20 mM Acetato de magnesio 10 mM Albúmina recombinante 100 µg/ml (pH 7,9 a 25 °C) Actividad en tampones NE Tampón NE™ r1.1: 10 % Tampón NE™ r2.1: 100 % Tampón NE™ r3.1: 10 % Tampón rCutSmart™: 100 % Compatibilidad del diluyente Diluyente A Tampón de almacenamiento Tris-HCl 10 mM KCl 50 mM DTT 1 mM EDTA 0,1 mM 200 µg/ml Albúmina recombinante 50 % Glicerol pH 7,4 @ 25 °C Inactivación por calor 65 °C durante 20 minutos Sensibilidad a la metilación Metilación en presas: no sensible Metilación en dcm: no sensible Metilación en CpG: bloqueada Preguntas frecuentes P: ¿SacII se ve afectado por la metilación? R: SacII se ve bloqueado por la metilación en CpG. Para obtener información actualizada sobre las sensibilidades a la metilación, visite Dam-Dcm y metilación en CpG o REBASE. P: ¿SacII se inhibe por la sal? R: Los niveles moderados de sal pueden inhibir SacII. Las preparaciones de ADN pueden tener altas concentraciones de sal. Si el volumen de ADN añadido a la reacción es un alto porcentaje del volumen total, la sal puede inhibir el corte. Aumentar el volumen de reacción puede ayudar. Es posible que sea necesario precipitar el ADN con etanol y lavarlo con etanol al 70 % para reducir la sal. La diálisis por gotas es la forma más eficaz de reducir la sal. P: ¿Se encuentran sitios lentos en vectores comunes? R: SacII muestra una fuerte preferencia de sitio. SacII requiere dos sitios de reconocimiento para activar la escisión. Intente reducir el volumen de reacción a 10 veces el volumen de la enzima añadida, o bien, añadir 30 unidades/microgramo e incubar de 2 a 3 horas. Añadir un oligonucleótido que contenga la secuencia será útil si solo hay un sitio en el ADN diana. (Conrad, M. y Topal, MD PNAS USA 86, 9707-9711 (1989), y Pein, C.-D., et al. (1991) NAR 19; 5139-5142). P: ¿Tengo que preparar las digestaciones con enzimas con certificación Time-Saver™ durante 5 a 15 minutos? ¿Puedo digerir durante más tiempo? R: Las enzimas Time-Saver™ de NEB tienen la ventaja de actuar rápidamente (5 a 15 minutos), pero también están diseñadas y certificadas para soportar digestaciones nocturnas sin degradar el ADN. P: Probé su enzima de restricción en el sustrato de ADN recomendado por NEB y parece estar activa; sin embargo, no digiere mi ADN. ¿Cuál podría ser la razón? R: La calidad y la limpieza del ADN son factores importantes que pueden afectar la actividad enzimática. Las enzimas de restricción activas en el tampón rCutSmart®, pero no tan activas en el tampón NE r2.1 o r3.1 (nuestros tampones con mayor concentración de sal), pueden verse inhibidas por la sal presente en la reacción. Los procedimientos de purificación de ADN que utilizan columnas de centrifugación pueden generar soluciones de ADN con niveles significativos de sal que pueden pasar a la reacción e inhibir la actividad enzimática. Para evitar esto, recomendamos que la solución de ADN añadida a la reacción no supere el 25 % del volumen total de la reacción. Esto se puede lograr ajustando el volumen total de la reacción según corresponda. P: ¿Qué enzimas de restricción de NEB se suministran con el colorante de carga de gel morado (6X)? R: Todas las enzimas de restricción con HF y la mayoría de las enzimas de restricción de NEB sin HF se suministran con el colorante de carga de gel morado (6X). Las enzimas de restricción no HF que vienen suministradas con el tinte púrpura son: AatII AsiSI BsmBI-v2 EagI MboI NlaIII PvuI SmaI Acil AvrII BspHI EcoRI MboII NotI RsaI SpeI AfeI BamHI BsrGI EcoRV MluI NspI SacI StuI AflII BbsI ClaI Esp3I FseI MseI PacI SacII AgeI BglII DdeI HaeIII MspI PciI SalI XbaI AluI BsaI DpnI HindIII NcoI PmeI SapI XhoI ApaI BseYI DpnII HpaI NdeI PsiI-v2 SfaNI XmaI ApeKI BsiWI DraI KpnI NheI PstI SfiI XmnI AscI * Todas las enzimas de restricción HF también se suministran con tinte de carga en gel, morado (6X) P: ¿Puedes contarme más? ¿Qué opina sobre la transición de BSA a albúmina recombinante (rAlbúmina) en los tampones NEB? R: NEB se complace en anunciar la transición de los tampones de reacción con BSA (NEBuffer 1.1, 2.1, 3.1 y CutSmart® Buffer) a tampones con albúmina recombinante (NEBuffer r1.1, r2.1, r3.1 y rCutSmart™ Buffer). También estamos en proceso de adaptar todas las formulaciones de enzimas de restricción para que contengan rAlbúmina. Creemos que dejar de usar productos de origen animal es un paso en la dirección correcta y podemos ofrecer esta mejora al mismo precio.