Laboratorios biológicos de Nueva Inglaterra, R0171S, HpaII

HpaII se ha reformulado con albúmina recombinante (rAlbúmina) a partir del lote n.º 10232250. Categorías relacionadas Detección y análisis de hidroximetilación, Enzimas de restricción sensibles y dependientes de la metilación para epigenética, Enzimas de restricción para análisis epigenético, Aplicaciones Clonación rápida: acelere sus flujos de trabajo de clonación con reactivos de NEB, Especificación de digestión con enzimas de restricción Definición de unidad Una unidad se define como la cantidad de enzima necesaria para digerir 1 µg de ADN λ en 1 hora a 37 °C en un volumen de reacción total de 50 μl. Condiciones de reacción Tampón rCutSmart™ 1X Incubar a 37 °C Tampón rCutSmart™ 1X Acetato de potasio 50 mM Tris-acetato 20 mM Acetato de magnesio 10 mM Albúmina recombinante 100 µg/ml (pH 7,9 a 25 °C) Actividad en tampones NE Tampón NE™ r1.1: 100 % Tampón NE™ r2.1: 50 % Tampón NE™ r3.1: <10 % Tampón rCutSmart™: 100 % Compatibilidad del diluyente Diluyente A Tampón de almacenamiento Tris-HCl 10 mM NaCl 50 mM DTT 1 mM EDTA 0,1 mM 200 µg/ml Albúmina recombinante 50 % Glicerol pH 7,4 @ 25 °C Inactivación por calor 80 °C durante 20 minutos Sensibilidad a la metilación dam metilación: No sensible dcm metilación: No sensible CpG Metilación: Bloqueada Preguntas frecuentes P: ¿La sal inhibe la HpaII? R: La HpaII se inhibe con concentraciones de sal de > 50 mM KCl. P: ¿La metilación afecta a la HpaII? R: La HpaII no cortará sitios si la 2.ª citosina de la secuencia de reconocimiento CCGG está metilada por la SssI metiltransferasa o la HpaII metiltransferasa. Cuando la 1.ª citosina de los sitios ha sido metilada por la MspI metiltransferasa, la enzima cortará 300 veces más lento que el ADN no metilado y 50 veces más lento si el ADN está hemimetilado. McClelland, M., Nelson, M., Raschke, E. (1994). Nucleic Acids Research 22, No. 17, 3640-3659. P: ¿Cuál es el peso molecular de HpaII? R: El peso molecular es de 40 kD, según lo estimado por PAGE. P: ¿La espermidina aumenta la actividad de HpaII? R: Solo es necesaria si solo hay un sitio HpaII presente. P: ¿HpaII escinde el ssDNA? R: No. P: ¿Cuál es la actividad de HpaII a 25 °C? R: HpaII tiene una actividad del 50-75 % a 25 °C. P: ¿Tengo que configurar las digestaciones con enzimas calificadas Time-Saver™ durante 5-15 minutos? ¿Puedo digerir durante más tiempo? R: Las enzimas Time-Saver™ de NEB tienen la ventaja de actuar rápidamente (5-15 minutos), pero también están diseñadas y calificadas para soportar digestaciones durante la noche sin degradar el ADN. P: Probé su enzima de restricción en el sustrato de ADN recomendado por NEB y parece estar activa; sin embargo, no digiere mi ADN. ¿Cuál podría ser la razón? R: La calidad y la limpieza del ADN son factores importantes que pueden afectar la actividad enzimática. Las enzimas de restricción activas en el tampón rCutSmart®, pero no tan activas en el tampón NE r2.1 o r3.1 (nuestros tampones con mayor concentración de sal), pueden verse inhibidas por la sal presente en la reacción. Los procedimientos de purificación de ADN que utilizan columnas de centrifugación pueden generar soluciones de ADN con niveles significativos de sal que pueden transferirse a la reacción e inhibir la actividad enzimática. Para evitar esto, recomendamos que la solución de ADN añadida a la reacción no supere el 25 % del volumen total de la reacción. Esto se puede lograr ajustando el volumen total de la reacción según corresponda. P: ¿Se encuentran sitios lentos de HpaII en vectores comunes? R: Existe un "sitio lento" en SV40. Este ADN solo tiene un sitio de corte. La actividad lenta puede deberse a que la enzima necesita dos sitios para cortar adecuadamente. Oller, RA, Broek, VW, Conrad, M., Topal, MD (1991) Biochemistry 30, p. 2543-2549. P: ¿Podrían explicarme más sobre la transición de BSA a albúmina recombinante (rAlbúmina) en los tampones NEB? R: En NEB nos complace anunciar que hemos cambiado los tampones de reacción con BSA (NEBuffer 1.1, 2.1, 3.1 y CutSmart®) por tampones con albúmina recombinante (NEBuffer r1.1, r2.1, r3.1 y rCutSmart™). También estamos en proceso de adaptar todas las formulaciones de enzimas de restricción para que contengan rAlbúmina. Creemos que dejar de usar productos de origen animal es un paso en la dirección correcta y podemos ofrecer esta mejora al mismo precio.