Laboratorios biológicos de Nueva Inglaterra, R0172S, SfaNI

El tamaño grande de este producto se discontinuó el 31/12/2020. El tamaño pequeño seguirá estando disponible. Categorías relacionadas: Endonucleasas de restricción S Aplicaciones: Digestión con enzimas de restricción Especificación: Definición de unidad: Una unidad se define como la cantidad de enzima necesaria para digerir 1 µg de ADN ΦX174 RF I en 1 hora a 37 °C en un volumen total de reacción de 50 μl. Condiciones de reacción 1X NEBuffer™ r3.1 Incubar a 37 °C 1X NEBuffer™ r3.1 100 mM NaCl 50 mM Tris-HCl 10 mM MgCl2 100 µg/ml Albúmina recombinante (pH 7,9 a 25 °C) Actividad en NEBuffers NEBuffer™ r1.1: <10 % NEBuffer™ r2.1: 75 % NEBuffer™ r3.1: 100 % Tampón rCutSmart™: 25 % Compatibilidad del diluyente Diluyente B Tampón de almacenamiento 10 mM Tris-HCl 300 mM NaCl 1 mM DTT 0,1 mM EDTA 500 µg/ml BSA 50 % Glicerol pH 7,4 a Inactivación por calor a 25 °C 65 °C durante 20 minutos Sensibilidad a la metilación Metilación en presas: no sensible Metilación en dcm: no sensible Metilación en CpG: afectada por algunas combinaciones de superposición Preguntas frecuentes P: ¿Se recomienda una digestión prolongada con SfaNI? R: No, el ADN puede degradarse. Las enzimas de tipo II, como SfaNI, a menudo arrojarán peores resultados si se añade más enzima de la necesaria o si se intenta una digestión de más de una hora. Este efecto no se debe a una nucleasa contaminante, sino a actividades adicionales inherentes de la enzima SfaNI. Debido a que esta enzima está compuesta por fracciones de reconocimiento y escisión distintas, la degradación aleatoria de la proteína durante una digestión larga ocasionalmente liberará una fracción de escisión activa que ya no está regulada por la fracción de reconocimiento. Por lo tanto, las digestas largas darán lugar a la creación de nucleasa. Esta propiedad no es lo mismo que la actividad estrella. P: ¿Por qué las bandas se difuminan después de la digestión con SfaNI cuando se ejecuta un gel de agarosa promedio? R: Esto se debe a la unión de la enzima al ADN, lo que altera la velocidad de migración (y/o causa manchas). Esto se puede remediar añadiendo un detergente iónico (como SDS al 0,1%) a la muestra antes de cargarla en el gel. Como alternativa, puede ser útil extraer la muestra con fenol o usar una columna de purificación de ADN de centrifugación rápida. Esta segunda causa se relaciona con la tendencia de algunas enzimas de restricción a permanecer unidas a su sustrato después de la escisión. Todas las enzimas de restricción tienen una afinidad de unión muy fuerte por sus sitios de reconocimiento. Además, todas tienen afinidades secundarias, relativamente bajas, por el ADN en general y por el semisitio resultante de la escisión. La intensidad de esta afinidad secundaria varía considerablemente entre las enzimas de restricción. En la mayoría de las enzimas de restricción, esta afinidad secundaria es lo suficientemente baja como para no observarse cuando los productos de digestión se procesan en un gel. Sin embargo, en el caso de varias enzimas de restricción, la unión secundaria altera la velocidad de migración de los fragmentos de ADN. P: ¿SfaNI escinde el ADNmc? R: No. P: ¿Qué enzimas de restricción NEB se suministran con el colorante de carga de gel morado (6X)? R: Todas las enzimas de restricción HF y la mayoría de las enzimas de restricción NEB no HF se suministran con el colorante de carga de gel morado (6X). Las enzimas de restricción no HF que vienen suministradas con el tinte púrpura son: AatII AsiSI BsmBI-v2 EagI MboI NlaIII PvuI SmaI Acil AvrII BspHI EcoRI MboII NotI RsaI SpeI AfeI BamHI BsrGI EcoRV MluI NspI SacI StuI AflII BbsI ClaI Esp3I FseI MseI PacI SacII AgeI BglII DdeI HaeIII MspI PciI SalI XbaI AluI BsaI DpnI HindIII NcoI PmeI SapI XhoI ApaI BseYI DpnII HpaI NdeI PsiI-v2 SfaNI XmaI ApeKI BsiWI DraI KpnI NheI PstI SfiI XmnI AscI * Todas las enzimas de restricción HF también se suministran con tinte de carga en gel, morado (6X) P: ¿Esta enzima es sensible a ¿Metilación de CpG en dam, dcm o mamíferos? R: Sí. Esta enzima no puede cortar los sitios de reconocimiento en el ADNg de mamíferos que se ven afectados por algunas combinaciones de metilación de CpG superpuesta. Para obtener información actualizada sobre la sensibilidad a la metilación, visite Dam-Dcm y metilación de CpG o REBASE. P: ¿Pueden darme más información sobre la transición de BSA a albúmina recombinante (rAlbúmina) en los tampones NEB? R: NEB se complace en anunciar que hemos cambiado los tampones de reacción con BSA (NEBuffer 1.1, 2.1, 3.1 y CutSmart®) por tampones con albúmina recombinante (NEBuffer r1.1, r2.1, r3.1 y rCutSmart™). También estamos en proceso de migrar todas las formulaciones de enzimas de restricción para que contengan rAlbúmina. Creemos que alejarnos de los productos que contienen ingredientes de origen animal es un paso en la dirección correcta y podemos ofrecer esta mejora al mismo precio.