Laboratorios biológicos de Nueva Inglaterra, R0182S, SphI

SphI se ha reformulado con albúmina recombinante (rAlbúmina) a partir del lote n.º 10172120. Categorías relacionadas Endonucleasas de restricción S Aplicaciones Digestión con enzimas de restricción Unidad de especificación Definición Una unidad se define como la cantidad de enzima necesaria para digerir 1 µg de ADN λ en 1 hora a 37 °C en un volumen de reacción total de 50 μl. Condiciones de reacción 1X NEBuffer™ r2.1 Incubar a 37 °C 1X NEBuffer™ r2.1 50 mM NaCl 10 mM Tris-HCl 10 mM MgCl2 100 µg/ml Albúmina recombinante (pH 7,9 a 25 °C) Actividad en NEBuffers NEBuffer™ r1.1: 100 % NEBuffer™ r2.1: 100 % NEBuffer™ r3.1: 50 % Tampón rCutSmart™: 100 % Compatibilidad del diluyente Diluyente B Tampón de almacenamiento 10 mM Tris-HCl 100 mM NaCl 1 mM DTT 0,1 mM EDTA 200 µg/ml Albúmina recombinante 50 % Glicerol pH 7,4 @ 25 °C Inactivación por calor 65 °C durante 20 minutos Sensibilidad a la metilación Metilación en presa: no sensible Metilación en dcm: no sensible Metilación en CpG: no sensible Preguntas frecuentes P: ¿Se requieren más unidades de SphI para cortar ADN superenrollado que ADN lambda? R: Sí, se requieren 4 unidades para escindir 1 μg de ADN tornasol, se requieren 2 unidades para pBR322 y 3 unidades para pUC19. P: ¿Cuál es la actividad de SphI a 25 °C? R: SphI tiene una actividad del 50-75 % a 25 °C. P: ¿SphI produce extremos compatibles de uso común? R: Escinde para dejar una extensión CATG 3' que se puede ligar de manera eficiente a fragmentos de ADN generados por NlaIII. P: ¿Cuál es el peso molecular de SphI? R: El PM de SphI es de 29 kDa según lo estimado por PAGE. P: ¿Qué es la actividad estrella y cómo se puede evitar? R: Se ha demostrado que, en condiciones extremas no estándar, las endonucleasas de restricción son capaces de escindir secuencias similares, pero no idénticas, a su secuencia de reconocimiento definida. Esta especificidad alterada o relajada se ha denominado actividad "estrella". Se ha sugerido que la actividad estrella puede ser una propiedad general de las endonucleasas de restricción y que cualquier endonucleasa de restricción puede escindir sitios no canónicos en ciertas condiciones extremas. La forma en que se altera la especificidad de una enzima depende de la enzima y de las condiciones empleadas para inducir la actividad estrella. Los tipos más comunes de actividad alterada son las sustituciones de bases individuales, el truncamiento de las bases externas en la secuencia de reconocimiento y el corte de hebras simples. La actividad estrella es completamente controlable en la gran mayoría de los casos y, por lo general, no es un problema al realizar digestores con endonucleasas de restricción. Las enzimas de New England Biolabs no mostrarán actividad estrella cuando se utilicen en las condiciones recomendadas en los NEBuffers suministrados. A continuación se listan las condiciones de reacción que se sabe que inducen o inhiben la actividad estelar. Condiciones que contribuyen a la actividad estelar 1. Alta concentración de glicerol [> 5% v/v] 2. Alta proporción de unidades a µg de ADN [varía con cada enzima, normalmente >100 unidades/µg] 3. Baja fuerza iónica [< 25 mM] 4. pH alto [> pH 8,0] 5. Presencia de disolventes orgánicos [DMSO, etanol, etilenglicol, dimetilacetamida, dimetilformamida, sulfalano] 6. Sustitución de Mg++ con otros cationes divalentes [Mn++, Cu++, Co++, Zn++] Inhibición de la actividad estelar Si le preocupa la actividad estelar, le recomendamos las siguientes pautas. 1. Utilice la menor cantidad de unidades posible para obtener una digestión completa. Esto evita la sobredigestión y reduce la concentración final de glicerol en la reacción. 2. Asegúrese de que la reacción esté libre de disolventes orgánicos, como alcoholes, que podrían estar presentes en la preparación de ADN. 3. Aumente la fuerza iónica del tampón de reacción a 100-150 mM (siempre que la enzima no se vea inhibida por un alto contenido de sal). 4. Disminuya el pH del tampón de reacción a pH 7,0. 5. Utilice Mg++ como catión divalente. P: ¿Es esta enzima sensible a la metilación de dam, dcm o CpG de mamíferos? R: No. Esta enzima no es sensible a la metilación de dam, dcm ni CpG de mamíferos. Para obtener información actualizada sobre la sensibilidad a la metilación, visite Dam-Dcm y metilación de CpG o REBASE. P: ¿Pueden darme más información sobre el cambio de BSA a albúmina recombinante (rAlbúmina) en los tampones NE? A: NEB se complace en anunciar que hemos cambiado los tampones de reacción con BSA (NEBuffer 1.1, 2.1, 3.1 y CutSmart® Buffer) por tampones con albúmina recombinante (NEBuffer r1.1, r2.1, r3.1 y rCutSmart™ Buffer). También estamos en proceso de adaptar todas las formulaciones de enzimas de restricción para que contengan albúmina recombinante. Creemos que dejar de usar productos con ingredientes de origen animal es un paso en la dirección correcta y podemos ofrecer esta mejora al mismo precio.