Biolabs de Nueva Inglaterra, R0193L, NcoI

Categorías relacionadas Endonucleasas de restricción: NO,, Enzimas de restricción calificadas que ahorran tiempo Aplicaciones Clonación rápida: acelere sus flujos de trabajo de clonación con reactivos de NEB,, Definición de unidad de especificación de digestión con enzimas de restricción Una unidad se define como la cantidad de enzima necesaria para digerir 1 µg de ADN λ en 1 hora a 37 °C en un volumen de reacción total de 50 μl. Condiciones de reacción 1X NEBuffer™ r3.1 Incubar a 37 °C 1X NEBuffer™ r3.1 100 mM NaCl 50 mM Tris-HCl 10 mM MgCl2 100 µg/ml Albúmina recombinante (pH 7,9 a 25 °C) Actividad en NEBuffers NEBuffer™ r1.1: 100 % NEBuffer™ r2.1: 100 % NEBuffer™ r3.1: 100 % Tampón rCutSmart™: 100 % Compatibilidad del diluyente Diluyente A Tampón de almacenamiento 10 mM Tris-HCl 50 mM KCl 1 mM DTT 0,1 mM EDTA 200 µg/ml Albúmina recombinante 50 % Glicerol pH 7.4 a 25 °C Inactivación por calor 80 °C durante 20 minutos Sensibilidad a la metilación dam metilación: No sensible metilación dcm: No sensible Metilación CpG: No sensible Preguntas frecuentes P: ¿Qué es la actividad estrella y cómo se puede evitar? R: Se ha demostrado que en condiciones extremas no estándar, las endonucleasas de restricción son capaces de escindir secuencias que son similares pero no idénticas a su secuencia de reconocimiento definida. Esta especificidad alterada o relajada se ha denominado actividad "estrella". Se ha sugerido que la actividad estrella puede ser una propiedad general de las endonucleasas de restricción y que cualquier endonucleasa de restricción puede ser hecha para escindir sitios no canónicos en ciertas condiciones extremas. La manera en que se altera la especificidad de una enzima depende de la enzima y de las condiciones empleadas para inducir la actividad estrella. Los tipos más comunes de actividad alterada son sustituciones de una sola base, truncamiento de las bases externas en la secuencia de reconocimiento y mellado de cadena sencilla. La actividad estrella es completamente controlable en la gran mayoría de los casos y generalmente no es una preocupación cuando se realizan digestas de endonucleasas de restricción. Las enzimas de New England Biolabs no exhibirán actividad estrella cuando se usen bajo las condiciones recomendadas en sus NEBuffers suministrados. A continuación se enumeran las condiciones de reacción que se sabe que inducen o inhiben la actividad estrella. Condiciones que contribuyen a la actividad estrella 1. Alta concentración de glicerol [> 5% v/v] 2. Alta proporción de unidades a µg de ADN [varía con cada enzima, usualmente >100 unidades/µg] 3. Baja fuerza iónica [< 25 mM] 4. Alto pH [> pH 8.0] 5. Presencia de solventes orgánicos [DMSO, etanol, etilenglicol, dimetilacetamida, dimetilformamida, sulfalano] 6. Sustitución de Mg++ con otros cationes divalentes [Mn++, Cu++, Co++, Zn++] Inhibición de la actividad estrella Si le preocupa la actividad estrella, le recomendamos las siguientes pautas. 1. Use la menor cantidad de unidades posible para lograr una digestión completa. Esto evita la sobredigestión y reduce la concentración final de glicerol en la reacción. 2. Asegúrese de que la reacción esté libre de disolventes orgánicos, como alcoholes, que podrían estar presentes en la preparación de ADN. 3. Aumente la fuerza iónica del tampón de reacción a 100-150 mM (siempre que la enzima no se inhiba por un alto contenido de sal). 4. Reduzca el pH del tampón de reacción a pH 7.0. 5. Use Mg++ como catión divalente. P: ¿Tengo que preparar las digestiones con enzimas calificadas Time-Saver™ durante 5-15 minutos? ¿Puedo digerir durante más tiempo? R: Las enzimas Time-Saver™ de NEB tienen la ventaja de actuar rápidamente (5-15 minutos), pero también están diseñadas y calificadas para soportar digestiones nocturnas sin degradar el ADN. P: ¿Qué enzimas de restricción de NEB se suministran con el colorante de carga de gel, púrpura (6X)? R: Todas las enzimas de restricción HF y la mayoría de las enzimas de restricción NEB no HF se suministran con colorante de carga de gel, púrpura (6X). Las enzimas de restricción no HF que vienen suministradas con el tinte púrpura son: AatII AsiSI BsmBI-v2 EagI MboI NlaIII PvuI SmaI Acil AvrII BspHI EcoRI MboII NotI RsaI SpeI AfeI BamHI BsrGI EcoRV MluI NspI SacI StuI AflII BbsI ClaI Esp3I FseI MseI PacI SacII AgeI BglII DdeI HaeIII MspI PciI SalI XbaI AluI BsaI DpnI HindIII NcoI PmeI SapI XhoI ApaI BseYI DpnII HpaI NdeI PsiI-v2 SfaNI XmaI ApeKI BsiWI DraI KpnI NheI PstI SfiI XmnI AscI * Todas las enzimas de restricción HF también se suministran con tinte de carga en gel, morado (6X) P: ¿Esta enzima es sensible a ¿Metilación de dam, dcm o CpG de mamíferos? R: No. Esta enzima no es sensible a la metilación de dam, dcm ni a la de CpG de mamíferos. Para obtener información actualizada sobre la sensibilidad a la metilación, visite Dam-Dcm y metilación de CpG o REBASE. P: ¿Podrían darme más información sobre la transición de BSA a albúmina recombinante (rAlbúmina) en los tampones NEB? R: NEB se complace en anunciar que hemos cambiado los tampones de reacción con BSA (NEBuffer 1.1, 2.1, 3.1 y CutSmart®) por tampones con albúmina recombinante (NEBuffer r1.1, r2.1, r3.1 y rCutSmart™). También estamos en proceso de migrar todas las formulaciones de enzimas de restricción para que contengan rAlbúmina. Creemos que alejarnos de los productos que contienen ingredientes de origen animal es un paso en la dirección correcta y podemos ofrecer esta mejora al mismo precio.