Laboratorios biológicos de Nueva Inglaterra, R0501S, RsrII

Requiere dos o más sitios de escisión. Consulte la lista de enzimas y las recomendaciones en las siguientes categorías relacionadas: Endonucleasas de restricción, Aplicaciones de PR, Digestión con enzimas de restricción, Unidad de especificación, Definición. Una unidad se define como la cantidad de enzima necesaria para digerir 1 µg de ADN λ en una hora a 37 °C en un volumen total de reacción de 50 μl. Condiciones de reacción Tampón rCutSmart™ 1X Incubar a 37 °C Tampón rCutSmart™ 1X Acetato de potasio 50 mM Tris-acetato 20 mM Acetato de magnesio 10 mM Albúmina recombinante 100 µg/ml (pH 7,9 a 25 °C) Actividad en tampones NE Tampón NE™ r1.1: 25 % Tampón NE™ r2.1: 75 % Tampón NE™ r3.1: 10 % Tampón rCutSmart™: 100 % Compatibilidad del diluyente Diluyente C Tampón de almacenamiento Tris-HCl 10 mM NaCl 250 mM DTT 1 mM EDTA 0,1 mM 200 µg/ml BSA 50 % Glicerol 0,15 % Triton® X-100 pH 7,4 a 25 °C Inactivación por calor 65 °C durante 20 minutos Sensibilidad a la metilación dam metilación: No sensible dcm metilación: No sensible CpG Metilación: Bloqueada Preguntas frecuentes P: ¿Los sitios de reconocimiento degenerados deben ser palindrómicos? R: La mayoría de los sitios de reconocimiento de enzimas de restricción son palindrómicos e incluyen solo pares de bases específicos (es decir, EcoRI reconoce GAATTC). Sin embargo, algunas enzimas tienen sitios degenerados, lo que significa que contienen uno o más pares de bases que no están específicamente definidos (es decir, BsrFI-v2 reconoce RCCGGY, donde R = A o G e Y = C o T). Para las enzimas degeneradas, cualquier base representada por el código de una sola letra puede estar presente en cualquier ubicación en el sitio de reconocimiento para que se produzca la escisión. Por ejemplo, BsrFI-v2 reconoce todas las siguientes secuencias: ACCGGC, ACCGGT, GCCGGC, GCCGGT. P: Probé su enzima de restricción en el sustrato de ADN recomendado por NEB y parece estar activa; sin embargo, no digiere mi ADN. ¿Cuál podría ser la razón? R: La calidad y la limpieza del ADN son factores importantes que pueden afectar la actividad enzimática. Las enzimas de restricción activas en el tampón rCutSmart®, pero no tan activas en el tampón NE r2.1 o r3.1 (nuestros tampones con mayor concentración de sal), pueden verse inhibidas por la sal presente en la reacción. Los procedimientos de purificación de ADN que utilizan columnas de centrifugación pueden generar soluciones de ADN con niveles significativos de sal que pueden pasar a la reacción e inhibir la actividad enzimática. Para evitar esto, recomendamos que la solución de ADN añadida a la reacción no supere el 25 % del volumen total de la reacción. Esto se puede lograr ajustando el volumen total de la reacción según corresponda. P: ¿Es esta enzima sensible a la metilación de CpG de mamíferos (dam), dcm o mamíferos? R: Sí. Esta enzima no puede cortar los sitios de reconocimiento en el ADNg de mamíferos que están bloqueados por la metilación de CpG. Para obtener información actualizada sobre la sensibilidad a la metilación, visite Dam-Dcm y metilación de CpG o REBASE. P: ¿Podrían darme más información sobre la transición de BSA a albúmina recombinante (rAlbúmina) en los tampones NEB? R: NEB se complace en anunciar que hemos cambiado los tampones de reacción con BSA (NEBuffer 1.1, 2.1, 3.1 y CutSmart®) a tampones con albúmina recombinante (NEBuffer r1.1, r2.1, r3.1 y rCutSmart™). También estamos en proceso de adaptar todas las formulaciones de enzimas de restricción para que contengan rAlbúmina. Creemos que dejar de usar productos con ingredientes de origen animal es un paso en la dirección correcta y podemos ofrecer esta mejora al mismo precio.