Laboratorios biológicos de Nueva Inglaterra, R0513S, AlwI

El tamaño grande de este producto se discontinuó el 15 de diciembre de 2025. El tamaño pequeño seguirá estando disponible. Categorías relacionadas Endonucleasas de restricción: A Aplicaciones Digestión con enzimas de restricción Unidad de especificación Definición Una unidad se define como la cantidad de enzima necesaria para digerir 1 µg de ADN λ ( dam -) en 1 hora a 37 °C en un volumen de reacción total de 50 μl. Condiciones de reacción Tampón rCutSmart™ 1X Incubar a 37 °C Tampón rCutSmart™ 1X Acetato de potasio 50 mM Tris-acetato 20 mM Acetato de magnesio 10 mM Albúmina recombinante 100 µg/ml (pH 7,9 a 25 °C) Actividad en tampones NE Tampón NE™ r1.1: 50 % Tampón NE™ r2.1: 50 % Tampón NE™ r3.1: 10 % Tampón rCutSmart™: 100 % Compatibilidad del diluyente Diluyente A Tampón de almacenamiento Tris-HCl 10 mM KCl 50 mM DTT 1 mM EDTA 0,1 mM 200 µg/ml Albúmina recombinante 50 % Glicerol pH 7,4 a Inactivación por calor a 25 °C Sin sensibilidad a la metilación Metilación en presas: bloqueada Metilación en dcm: no sensible Metilación en CpG: no sensible Preguntas frecuentes P: ¿AlwI está bloqueado por la metilación en presas? R: Sí. P: ¿Por qué es difícil ligar el ADN cortado con AlwI? R: Los salientes de un solo par de bases son sustratos pobres para la ADN ligasa T4: se anillan muy mal y son tan difíciles de ligar como los fragmentos de ADN con extremos romos. Además, para AlwI, el saliente no está restringido a ningún nucleótido en particular; las cuatro bases están representadas de forma aproximadamente igual. En consecuencia, cualquier saliente dado es compatible solo con el 25 % de los otros salientes presentes. Esto reduce la eficiencia de la ligadura en relación con los salientes generados por enzimas de restricción que solo dejan salientes mutuamente compatibles. La eficiencia de la ligadura se puede aumentar utilizando nuestra mezcla maestra Blunt/TA Ligase. P: ¿Por qué no se recomienda una digestión extendida? R: Porque existe una actividad de exonnucleasa o endonucleasa inespecífica que parece ser una propiedad de la enzima. P: Probé su enzima de restricción en el ADN sustrato recomendado por NEB y parece estar activa; sin embargo, no digiere mi ADN. ¿Cuál podría ser la razón? R: La calidad y la limpieza del ADN son factores importantes que pueden afectar la actividad enzimática. Las enzimas de restricción activas en el tampón rCutSmart®, pero no tan activas en el tampón NE r2.1 o r3.1 (nuestros tampones con mayor concentración de sal), pueden verse inhibidas por la sal presente en la reacción. Los procedimientos de purificación de ADN que utilizan columnas de centrifugación pueden generar soluciones de ADN con niveles significativos de sal que pueden transferirse a la reacción e inhibir la actividad enzimática. Para evitar esto, recomendamos que la solución de ADN añadida a la reacción no supere el 25 % del volumen total de la reacción. Esto se puede lograr ajustando el volumen total de la reacción según corresponda. P: ¿Podrían contarme más sobre la transición de BSA a albúmina recombinante (rAlbúmina) en los tampones NEB? R: En NEB nos complace anunciar que hemos cambiado los tampones de reacción con BSA (NEBuffer 1.1, 2.1, 3.1 y CutSmart®) por tampones con albúmina recombinante (NEBuffer r1.1, r2.1, r3.1 y rCutSmart™). También estamos en proceso de adaptar todas las formulaciones de enzimas de restricción para que contengan rAlbúmina. Creemos que dejar de usar productos de origen animal es un paso en la dirección correcta y podemos ofrecer esta mejora al mismo precio.