Laboratorios biológicos de Nueva Inglaterra, R0528L, EarI

EarI se ha reformulado con albúmina recombinante (rAlbúmina) a partir del lote n.º 10180739. Categorías relacionadas Endonucleasas de restricción CG,, Enzimas de restricción calificadas que ahorran tiempo Aplicaciones Especificación de digestión con enzimas de restricción Definición de unidad Una unidad se define como la cantidad de enzima necesaria para digerir 1 µg de ADN λ en 1 hora a 37 °C en un volumen de reacción total de 50 μl. Condiciones de reacción Tampón rCutSmart™ 1X Incubar a 37 °C Tampón rCutSmart™ 1X Acetato de potasio 50 mM Tris-acetato 20 mM Acetato de magnesio 10 mM Albúmina recombinante 100 µg/ml (pH 7,9 a 25 °C) Actividad en tampones NE Tampón NE™ r1.1: 50 % Tampón NE™ r2.1: 10 % Tampón NE™ r3.1: <10 % Tampón rCutSmart™: 100 % Compatibilidad del diluyente Diluyente B Tampón de almacenamiento Tris-HCl 10 mM NaCl 300 mM DTT 1 mM EDTA 0,1 mM Albúmina recombinante 500 µg/ml Glicerol al 50 % pH 7,4 @ 25 °C Inactivación por calor 65 °C durante 20 minutos Sensibilidad a la metilación dam metilación: No sensible dcm metilación: No sensible Metilación de CpG: Deteriorada por la superposición Preguntas frecuentes P: ¿EarI está bloqueado por la metilación como su isoesquizómero, Eam1104I? R: EarI está bloqueado por la metilación superpuesta de CpG. P: ¿EarI se utiliza en alguna técnica especial? R: Stratagene desarrolló un método llamado clonación sin costuras utilizando Eam1104I y PCR descrito por Padgett y Soge en Gene 168 (1996) pp31-35. NEB no tiene licencia para ninguna de estas técnicas. La técnica utiliza un cebador que contiene el lado del sitio asimétrico que contiene citosina. La PCR se realiza utilizando metilcitosina. Todos los sitios internos se bloquean dejando solo los sitios generados por el cebador como escindibles por Eam1104I o un isoesquizómero con una sensibilidad de metilación similar. P: ¿Cuál es la actividad de EarI a 25 °C? R: EarI tiene una actividad del 25-50 % a 25 °C. P: ¿Tengo que preparar las digestas con enzimas calificadas Time-Saver™ durante 5-15 minutos? ¿Puedo digerir durante más tiempo? R: Las enzimas Time-Saver™ de NEB tienen la ventaja de actuar rápidamente (5-15 minutos), pero también están diseñadas y calificadas para soportar digestaciones nocturnas sin degradación del ADN. P: Probé su enzima de restricción en el ADN sustrato recomendado por NEB y parece estar activa; sin embargo, no digiere mi ADN. ¿Cuál podría ser la razón? R: La calidad y la limpieza del ADN son factores importantes que pueden afectar la actividad enzimática. Las enzimas de restricción activas en el tampón rCutSmart®, pero no tan activas en el tampón NE r2.1 o r3.1 (nuestros tampones con mayor concentración de sal), pueden verse inhibidas por la sal en la reacción. Los procedimientos de purificación de ADN que utilizan columnas de centrifugación pueden generar soluciones de ADN con niveles significativos de sal que pueden transferirse a la reacción e inhibir la actividad enzimática. Para evitarlo, recomendamos que la solución de ADN añadida a la reacción no supere el 25 % del volumen total de reacción. Esto se puede lograr ajustando el volumen total de reacción según corresponda. P: ¿Pueden darme más información sobre la transición de BSA a albúmina recombinante (rAlbúmina) en los tampones NEB? R: NEB se complace en anunciar que hemos cambiado los tampones de reacción con BSA (NEBuffer 1.1, 2.1, 3.1 y CutSmart® Buffer) por tampones con albúmina recombinante (NEBuffer r1.1, r2.1, r3.1 y rCutSmart™ Buffer). También estamos en proceso de migrar todas las formulaciones de enzimas de restricción para que contengan rAlbúmina. Creemos que alejarnos de los productos que contienen ingredientes de origen animal es un paso en la dirección correcta y podemos ofrecer esta mejora al mismo precio.