Laboratorios Biológicos de Nueva Inglaterra, R0532S, PmlI

Categorías relacionadas Endonucleasas de restricción PR,, Enzimas de restricción calificadas que ahorran tiempo Aplicaciones Especificación de digestión con enzimas de restricción Definición de unidad Una unidad se define como la cantidad de enzima necesaria para digerir 1 µg de ADN λ (digestión con HindIII) en 1 hora a 37 °C en un volumen de reacción total de 50 μl. Condiciones de reacción Tampón rCutSmart™ 1X Incubar a 37 °C Tampón rCutSmart™ 1X Acetato de potasio 50 mM Tris-acetato 20 mM Acetato de magnesio 10 mM Albúmina recombinante 100 µg/ml (pH 7,9 a 25 °C) Actividad en tampones NE Tampón NE™ r1.1: 100 % Tampón NE™ r2.1: 50 % Tampón NE™ r3.1: <10 % Tampón rCutSmart™: 100 % Compatibilidad del diluyente Diluyente A Tampón de almacenamiento Tris-HCl 25 mM KCl 25 mM DTT 1 mM EDTA 0,5 mM 200 µg/ml BSA Glicerol al 50 % pH 7,4 a Inactivación por calor a 25 °C 65 °C durante 20 minutos Sensibilidad a la metilación Metilación en dam: no sensible Metilación en dcm: no sensible Metilación de CpG: bloqueada Preguntas frecuentes P: ¿La metilación afecta a PmlI? R: La metilación de CpG bloquea PmlI. Para obtener información actualizada sobre las sensibilidades a la metilación, visite Dam-Dcm y metilación de CpG o REBASE. P: ¿La sal inhibe PmlI? R: PmlI se inhibe en concentraciones de sal superiores a 10 mM. El ADN de minipreparación que contiene sal residual debe lavarse con ETOH al 70 % o dializarse. P: ¿Se recomienda la digestión durante la noche con PmlI? R: No, no se recomiendan las digestiones de 16 horas porque PmlI pierde actividad durante la reacción. P: ¿Cuál es la actividad de PmlI a 25 °C? R: PmlI es 100 % activo a 25 °C. P: ¿Tengo que preparar las digestas con enzimas con certificación Time-Saver™ durante 5 a 15 minutos? ¿Puedo digerir durante más tiempo? R: Las enzimas Time-Saver™ de NEB tienen la ventaja de actuar rápidamente (5 a 15 minutos), pero también están diseñadas y certificadas para soportar digestaciones nocturnas sin degradar el ADN. P: Probé su enzima de restricción en el ADN sustrato recomendado por NEB y parece estar activa; sin embargo, no digiere mi ADN. ¿Cuál podría ser la razón? R: La calidad y la limpieza del ADN son factores importantes que pueden afectar la actividad enzimática. Las enzimas de restricción activas en el tampón rCutSmart®, pero no tan activas en el tampón NE r2.1 o r3.1 (nuestros tampones con mayor concentración de sal), pueden verse inhibidas por la sal presente en la reacción. Los procedimientos de purificación de ADN que utilizan columnas de centrifugación pueden generar soluciones de ADN con niveles significativos de sal que pueden transferirse a la reacción e inhibir la actividad enzimática. Para evitar esto, recomendamos que la solución de ADN añadida a la reacción no supere el 25 % del volumen total de reacción. Esto se puede lograr ajustando el volumen total de reacción según corresponda. P: ¿Pueden darme más información sobre la transición de BSA a albúmina recombinante (rAlbúmina) en los tampones NEB? R: En NEB nos complace anunciar que hemos cambiado los tampones de reacción con BSA (NEBuffer 1.1, 2.1, 3.1 y CutSmart® Buffer) por tampones con albúmina recombinante (NEBuffer r1.1, r2.1, r3.1 y rCutSmart™ Buffer). También estamos en proceso de adaptar todas las formulaciones de enzimas de restricción para que contengan rAlbúmina. Creemos que dejar de usar productos con ingredientes de origen animal es un paso en la dirección correcta y podemos ofrecer esta mejora al mismo precio.