Laboratorios Biológicos de Nueva Inglaterra, R0537S, BsaBI

BsaBI ha sido reformulado con albúmina recombinante (rAlbúmina) a partir del lote n.º 10268406. Categorías relacionadas Endonucleasas de restricción B Aplicaciones Digestión con enzimas de restricción Unidad de especificación Definición Una unidad se define como la cantidad de enzima necesaria para digerir 1 µg de ADN λ (dam - ) en 1 hora a 60 °C en un volumen de reacción total de 50 μl. Condiciones de reacción Tampón rCutSmart™ 1X Incubar a 60 °C Tampón rCutSmart™ 1X Acetato de potasio 50 mM Tris-acetato 20 mM Acetato de magnesio 10 mM Albúmina recombinante 100 µg/ml (pH 7,9 a 25 °C) Actividad en tampones NE Tampón NE™ r1.1: 50 % Tampón NE™ r2.1: 100 % Tampón NE™ r3.1: 75 % Tampón rCutSmart™: 100 % Compatibilidad del diluyente Diluyente B Tampón de almacenamiento Tris-HCl 10 mM NaCl 300 mM DTT 1 mM EDTA 0,1 mM Albúmina recombinante 500 µg/ml Glicerol pH 7.4 a 25 °C Inactivación por calor 80 °C durante 20 minutos Sensibilidad a la metilación dam metilación: Bloqueada por superposición dcm metilación: No sensible Metilación CpG: Bloqueada por algunas combinaciones de superposición Actividad a temperatura a 37 °C: 25 % Preguntas frecuentes P: ¿Qué es la actividad estrella y cómo se puede evitar? R: Se ha demostrado que en condiciones extremas no estándar, las endonucleasas de restricción son capaces de escindir secuencias que son similares pero no idénticas a su secuencia de reconocimiento definida. Esta especificidad alterada o relajada se ha denominado actividad "estrella". Se ha sugerido que la actividad estrella puede ser una propiedad general de las endonucleasas de restricción y que cualquier endonucleasa de restricción puede ser hecha para escindir sitios no canónicos en ciertas condiciones extremas. La manera en que se altera la especificidad de una enzima depende de la enzima y de las condiciones empleadas para inducir la actividad estrella. Los tipos más comunes de actividad alterada son las sustituciones de bases individuales, el truncamiento de las bases externas en la secuencia de reconocimiento y el corte de cadenas simples. La actividad estrella es completamente controlable en la gran mayoría de los casos y generalmente no representa un problema al realizar digestores con endonucleasas de restricción. Las enzimas de New England Biolabs no presentan actividad estrella cuando se utilizan en las condiciones recomendadas en los NEBuffers suministrados. A continuación, se enumeran las condiciones de reacción que se sabe que inducen o inhiben la actividad estrella. Condiciones que contribuyen a la actividad estelar 1. Alta concentración de glicerol [> 5% v/v] 2. Alta proporción de unidades a µg de ADN [varía con cada enzima, normalmente >100 unidades/µg] 3. Baja fuerza iónica [< 25 mM] 4. pH alto [> pH 8,0] 5. Presencia de disolventes orgánicos [DMSO, etanol, etilenglicol, dimetilacetamida, dimetilformamida, sulfalano] 6. Sustitución de Mg++ por otros cationes divalentes [Mn++, Cu++, Co++, Zn++] Inhibición de la actividad estelar Si le preocupa la actividad estelar, le recomendamos las siguientes directrices. 1. Utilice la menor cantidad de unidades posible para obtener una digestión completa. Esto evita la sobredigestión y reduce la concentración final de glicerol en la reacción. 2. Asegúrese de que la reacción esté libre de disolventes orgánicos, como alcoholes, que podrían estar presentes en la preparación de ADN. 3. Aumente la fuerza iónica del tampón de reacción a 100-150 mM (siempre que la enzima no esté inhibida por un alto contenido de sal). 4. Disminuya el pH del tampón de reacción a pH 7,0. 5. Utilice Mg++ como catión divalente. P: ¿Los sitios de reconocimiento degenerados deben ser palindrómicos? R: La mayoría de los sitios de reconocimiento de enzimas de restricción son palindrómicos e incluyen solo pares de bases específicos (es decir, EcoRI reconoce GAATTC). Sin embargo, algunas enzimas tienen sitios degenerados, lo que significa que contienen uno o más pares de bases que no están específicamente definidos (es decir, BsrFI-v2 reconoce RCCGGY, donde R = A o G e Y = C o T). Para las enzimas degeneradas, cualquier base representada por el código de una sola letra puede estar presente en cualquier ubicación en el sitio de reconocimiento para que se produzca la escisión. Por ejemplo, BsrFI-v2 reconoce todas las siguientes secuencias: ACCGGC, ACCGGT, GCCGGC, GCCGGT. P: ¿Es esta enzima sensible a la metilación de dam, dcm o CpG de mamíferos? R: Sí. Esta enzima no puede cortar los sitios de reconocimiento bloqueados por la metilación solapada de dam o por algunas combinaciones de metilación solapada de CpG. Para obtener información actualizada sobre la sensibilidad a la metilación, visite Dam-Dcm y metilación de CpG o REBASE. P: ¿Pueden darme más información sobre la transición de BSA a albúmina recombinante (rAlbúmina) en los tampones NEB? R: NEB se complace en anunciar que hemos cambiado los tampones de reacción con BSA (NEBuffer 1.1, 2.1, 3.1 y CutSmart® Buffer) por tampones con albúmina recombinante (NEBuffer r1.1, r2.1, r3.1 y rCutSmart™ Buffer). También estamos en proceso de migrar todas las formulaciones de enzimas de restricción para que contengan rAlbúmina. Creemos que alejarnos de los productos que contienen ingredientes de origen animal es un paso en la dirección correcta y podemos ofrecer esta mejora al mismo precio.