Laboratorios biológicos de Nueva Inglaterra, R0539S, BbsI

Aprenda sobre la fidelidad de la ligasa y supere los límites de las categorías relacionadas Endonucleasas de restricción B,, Aplicaciones de enzimas de restricción calificadas que ahorran tiempo Ensamblaje NEBridge® Golden Gate ,, Clonación rápida: acelere sus flujos de trabajo de clonación con reactivos de NEB,, Definición de unidad de especificación de digestión con enzimas de restricción Una unidad se define como la cantidad de enzima necesaria para digerir 1 µg de ADN λ en 1 hora a 37 °C en un volumen de reacción total de 50 μl. Condiciones de reacción 1X NEBuffer™ r2.1 Incubar a 37 °C 1X NEBuffer™ r2.1 50 mM NaCl 10 mM Tris-HCl 10 mM MgCl2 100 µg/ml Albúmina recombinante (pH 7,9 a 25 °C) Actividad en NEBuffers NEBuffer™ r1.1: 100 % NEBuffer™ r2.1: 100 % NEBuffer™ r3.1: 25 % Tampón rCutSmart™: 75 % Compatibilidad del diluyente Diluyente B Tampón de almacenamiento 10 mM Tris-HCl 300 mM NaCl 1 mM DTT 0,1 mM EDTA 500 µg/ml Albúmina recombinante 50 % Glicerol pH 7,4 a Inactivación por calor a 25 °C 65 °C durante 20 minutos Sensibilidad a la metilación Metilación de presas: no sensible Metilación de dcm: no sensible Metilación de CpG: no sensible Preguntas frecuentes P: ¿Tengo que preparar las digestiones con enzimas cualificadas Time-Saver™ durante 5-15 minutos? ¿Puedo digerir durante más tiempo? R: Las enzimas Time-Saver™ de NEB tienen la ventaja de trabajar rápido (5-15 minutos), pero también están diseñadas y cualificadas para soportar digestiones durante la noche sin degradación del ADN. P: ¿Cuál es la actividad de BbsI a 25 °C? R: BbsI tiene una actividad de aproximadamente el 25 % a 25 °C. P: ¿Qué enzimas de restricción de NEB se suministran con el colorante de carga de gel morado (6X)? R: Todas las enzimas de restricción de HF y la mayoría de las enzimas de restricción de NEB que no son HF se suministran con el colorante de carga de gel morado (6X). Las enzimas de restricción no HF que vienen suministradas con el tinte púrpura son: AatII AsiSI BsmBI-v2 EagI MboI NlaIII PvuI SmaI Acil AvrII BspHI EcoRI MboII NotI RsaI SpeI AfeI BamHI BsrGI EcoRV MluI NspI SacI StuI AflII BbsI ClaI Esp3I FseI MseI PacI SacII AgeI BglII DdeI HaeIII MspI PciI SalI XbaI AluI BsaI DpnI HindIII NcoI PmeI SapI XhoI ApaI BseYI DpnII HpaI NdeI PsiI-v2 SfaNI XmaI ApeKI BsiWI DraI KpnI NheI PstI SfiI XmnI AscI * Todas las enzimas de restricción HF también se suministran con tinte de carga en gel, morado (6X) P: ¿Qué enzimas de restricción son ¿Se utiliza en el ensamblaje GoldenBraid? R: BsaI es una enzima de tipo IIS que se utiliza en este método. NEB también ofrece una versión de alta fidelidad de esta enzima, BsaI-HF®v2, que cuenta con la ventaja adicional de estar certificada como Time-Saver™ (puede digerir el ADN en 5-15 minutos y se puede digerir de forma segura durante la noche) y presenta una actividad estrella reducida. BsaI-HFv2 funciona en el tampón CutSmart®, al igual que la ADN ligasa T4 (también parte del flujo de trabajo GoldenBraid), que es 100 % funcionalmente activa en este tampón cuando la reacción se complementa con 1 mM de ATP. Otras enzimas de tipo IIS que se utilizan en GoldenBraid incluyen BsmBI-v2/Esp3I, BtgZI, BbsI/BbsI-HF y PaqCI (isoesquizómero AarI con secuencia de reconocimiento de 7 pb). Referencia: GoldenBraid 2.0: Un marco integral de ensamblaje de ADN para la biología sintética de plantas. P: ¿Qué enzimas de restricción se utilizan en el ensamblaje Golden Gate? R: El ensamblaje Golden Gate es un método de clonación eficiente en un solo tubo basado en enzimas de restricción de tipo IIS que escinden fuera de sus sitios de reconocimiento y dejan salientes de 3 o 4 bases. BsaI es la enzima de tipo IIS más utilizada para el ensamblaje Golden Gate. NEB también ofrece una versión de alta fidelidad de esta enzima, BsaI-HF®v2, que cuenta con la ventaja adicional de estar certificada por Time-Saver™ (puede digerir el ADN en 5-15 minutos o durante la noche sin degradarlo) y presenta una actividad estrella drásticamente reducida. Otras enzimas de tipo IIS utilizadas en el ensamblaje Golden Gate incluyen BsmBI-v2/Esp3I, BbsI/BbsI-HF, PaqCI (isoesquizómero AarI con secuencia de reconocimiento de 7 pb) y SapI/BspQI/BspQI-HF (con secuencia de reconocimiento de 7 pb y salientes de 3 pb). P: ¿Es esta enzima sensible a la metilación de CpG de dam, dcm o mamíferos? R: No. Esta enzima no es sensible a la metilación de CpG de dam, dcm o mamíferos. Para obtener información actualizada sobre la sensibilidad a la metilación, visite Dam-Dcm y metilación de CpG o REBASE. P: ¿Podrían darme más información sobre la transición de BSA a albúmina recombinante (rAlbúmina) en los NEBuffers? R: NEB se complace en anunciar la sustitución de los tampones de reacción con BSA (NEBuffer 1.1, 2.1, 3.1 y CutSmart® Buffer) por tampones con albúmina recombinante (NEBuffer r1.1, r2.1, r3.1 y rCutSmart™ Buffer). También estamos en proceso de adaptar todas las formulaciones de enzimas de restricción para que contengan albúmina recombinante. Consideramos que dejar de usar productos de origen animal es un paso en la dirección correcta y podemos ofrecer esta mejora al mismo precio. P: ¿Cuáles son las condiciones de almacenamiento de BbsI? R: BbsI se puede almacenar a -20 °C o -80 °C. P: En el caso de las enzimas almacenadas a -80 °C, ¿se ve afectada su actividad tras múltiples ciclos de congelación/descongelación? R: Las siguientes enzimas mantuvieron su actividad completa tras 10 ciclos de congelación-descongelación. Si necesita más de 10 ciclos de congelación-descongelación, le recomendamos dividir la enzima en alícuotas más pequeñas y congelar cada alícuota a -80 °C. Cac8I EagI-HF I-SceI KasI NlaIII Nota: FseI mantuvo su actividad completa solo durante 5 ciclos de congelación/descongelación.