New England Biolabs, R0544S, KasI

KasI se ha reformulado con albúmina recombinante (rAlbúmina) a partir del lote n.º 10211225. Categorías relacionadas Endonucleasas de restricción Aplicaciones HM Digestión con enzimas de restricción Unidad de especificación Definición Una unidad se define como la cantidad de enzima necesaria para digerir 1 µg de ADN pBR322 en 1 hora a 37 °C en un volumen de reacción total de 50 μl. Condiciones de reacción Tampón rCutSmart™ 1X Incubar a 37 °C Tampón rCutSmart™ 1X Acetato de potasio 50 mM Tris-acetato 20 mM Acetato de magnesio 10 mM Albúmina recombinante 100 µg/ml (pH 7,9 a 25 °C) Actividad en tampones NE Tampón NE™ r1.1: 50 % Tampón NE™ r2.1: 100 % Tampón NE™ r3.1: 50 % Tampón rCutSmart™: 100 % Compatibilidad del diluyente Diluyente B Tampón de almacenamiento KCl 100 mM Tris-HCl 10 mM DTT EDTA 0,1 mM 50 % Glicerol 200 µg/ml Albúmina recombinante pH 7 a Inactivación por calor a 25 °C 65 °C durante 20 minutos Sensibilidad a la metilación Metilación en dam: no sensible Metilación en dcm: no sensible Metilación de CpG: bloqueada Preguntas frecuentes P: ¿KasI se ve afectado por la metilación? R: KasI se ve bloqueado por la metilación de CpG. Para obtener información actualizada sobre las sensibilidades a la metilación, visite Dam-Dcm y metilación de CpG o REBASE. P: ¿Se recomienda la digestión prolongada de KasI? R: La digestión prolongada no es beneficiosa porque la enzima no es estable en la reacción. P: ¿Se requieren más unidades de KasI para cortar ADN superenrollado que ADN lambda? R: Sí, se requieren 4 unidades para escindir 1 μg de ADN tornasol. P: ¿Se observa pérdida de actividad de KasI en 6 meses o menos? R: Sí, la pérdida se puede observar después de 6 meses de almacenamiento a -20 °C. KasI se debe almacenar a -80 °C; Para evitar múltiples congelaciones y descongelaciones, por favor, tome una alícuota de la enzima y consérvela a –80 °C. P: Probé su enzima de restricción en el ADN sustrato recomendado por NEB y parece estar activo, sin embargo, no digiere mi ADN. ¿Cuál podría ser la razón? R: La calidad y la limpieza del ADN son factores principales que pueden afectar la actividad enzimática. Las enzimas de restricción activas en el tampón rCutSmart®, pero no tan activas en el tampón NE r2.1 y/o r3.1 (nuestros tampones con mayor concentración de sal), pueden ser inhibidas por la sal en la reacción. Los procedimientos de purificación de ADN que utilizan columnas de centrifugación pueden dar como resultado soluciones de ADN con niveles significativos de sal que pueden transferirse a la reacción e inhibir la actividad enzimática. Para evitar esto, recomendamos que la solución de ADN añadida a la reacción no supere el 25 % del volumen total de la reacción. Esto se puede lograr ajustando el volumen total de la reacción como corresponda. P: ¿Qué isoesquizómeros existen? R: NEB vende dos neoesquizómeros de KasI. KasI escinde G/GCGCC, NarI corta GG/CGCC y SfoI corta para dejar extremos GGC/GCC romos. Tanto KasI como NarI tienen preferencia de sitio, escindiendo algunos sitios muy lentamente. SfoI no muestra preferencia de sitio. P: ¿Se encuentran sitios lentos en vectores comunes? R: Kas es 25 veces más activo en lambda que en pBR3222. Los sitios lentos no se han mapeado. P: ¿Pueden darme más información sobre el cambio de BSA a albúmina recombinante (rAlbúmina) en los tampones NEB? R: NEB se complace en anunciar que hemos cambiado los tampones de reacción con BSA (NEBuffer 1.1, 2.1, 3.1 y CutSmart® Buffer) a tampones con albúmina recombinante (NEBuffer r1.1, r2.1, r3.1 y rCutSmart™ Buffer). También estamos en proceso de adaptar todas las formulaciones de enzimas de restricción para que contengan albúmina recombinante. Consideramos que dejar de usar productos de origen animal es un paso en la dirección correcta y podemos ofrecer esta mejora al mismo precio. P: En el caso de las enzimas almacenadas a -80 °C, ¿se ve afectada su actividad después de múltiples ciclos de congelación/descongelación? R: Las siguientes enzimas mantuvieron su actividad completa al ser probadas durante 10 ciclos de congelación/descongelación. Si necesita más de 10 ciclos de congelación/descongelación, recomendamos dividir la enzima en alícuotas más pequeñas y congelar cada alícuota a -80 °C. Cac8I EagI-HF I-SceI KasI NlaIII. Nota: FseI mantuvo su actividad completa solo durante 5 ciclos de congelación/descongelación.