Laboratorios biológicos de Nueva Inglaterra, R0546S, TfiI

TfiI ha sido reformulado con albúmina recombinante (rAlbúmina) a partir del lote n.º 10284615. Categorías relacionadas Endonucleasas de restricción TZ,, Enzimas de restricción calificadas que ahorran tiempo Aplicaciones Clonación rápida: acelere sus flujos de trabajo de clonación con reactivos de NEB,, Especificación de digestión con enzimas de restricción Definición de unidad Una unidad se define como la cantidad de enzima necesaria para digerir 1 µg de ADN λ en 1 hora a 65 °C en un volumen de reacción total de 50 μl. Condiciones de reacción Tampón rCutSmart™ 1X Incubar a 65 °C Tampón rCutSmart™ 1X Acetato de potasio 50 mM Tris-acetato 20 mM Acetato de magnesio 10 mM Albúmina recombinante 100 µg/ml (pH 7,9 a 25 °C) Actividad en tampones NE Tampón NE™ r1.1: 50 % Tampón NE™ r2.1: 100 % Tampón NE™ r3.1: 100 % Tampón rCutSmart™: 100 % Compatibilidad del diluyente Diluyente C Tampón de almacenamiento Tris-HCl 10 mM NaCl 250 mM DTT 1 mM EDTA 0,1 mM 200 µg/ml Albúmina recombinante 50 % Glicerol 0,15 % Triton® X-100 pH 7,4 a 25 °C Inactivación por calor Sin sensibilidad a la metilación Metilación en diques: No sensible Metilación en dcm: No sensible Metilación en CpG: Bloqueada por algunas combinaciones de actividad superpuesta a temperatura a 37 °C: 10 % Preguntas frecuentes P: ¿Qué es la actividad estrella y cómo se puede evitar? R: Se ha demostrado que, en condiciones extremas no estándar, las endonucleasas de restricción son capaces de escindir secuencias que son similares, pero no idénticas, a su secuencia de reconocimiento definida. Esta especificidad alterada o relajada se ha denominado actividad "estrella". Se ha sugerido que la actividad estrella puede ser una propiedad general de las endonucleasas de restricción y que cualquier endonucleasa de restricción puede ser capaz de escindir sitios no canónicos en ciertas condiciones extremas. La manera en que se altera la especificidad de una enzima depende de la enzima y de las condiciones empleadas para inducir la actividad estrella. Los tipos más comunes de actividad alterada son las sustituciones de bases individuales, el truncamiento de las bases externas en la secuencia de reconocimiento y el corte de cadenas simples. La actividad estrella es completamente controlable en la gran mayoría de los casos y generalmente no representa un problema al realizar digestores con endonucleasas de restricción. Las enzimas de New England Biolabs no presentan actividad estrella cuando se utilizan en las condiciones recomendadas en los NEBuffers suministrados. A continuación, se enumeran las condiciones de reacción que se sabe que inducen o inhiben la actividad estrella. Condiciones que contribuyen a la actividad estelar 1. Alta concentración de glicerol [> 5% v/v] 2. Alta proporción de unidades a µg de ADN [varía con cada enzima, normalmente >100 unidades/µg] 3. Baja fuerza iónica [< 25 mM] 4. pH alto [> pH 8,0] 5. Presencia de disolventes orgánicos [DMSO, etanol, etilenglicol, dimetilacetamida, dimetilformamida, sulfalano] 6. Sustitución de Mg++ por otros cationes divalentes [Mn++, Cu++, Co++, Zn++] Inhibición de la actividad estelar Si le preocupa la actividad estelar, le recomendamos las siguientes directrices. 1. Utilice la menor cantidad de unidades posible para obtener una digestión completa. Esto evita la sobredigestión y reduce la concentración final de glicerol en la reacción. 2. Asegúrese de que la reacción esté libre de disolventes orgánicos, como alcoholes, que podrían estar presentes en la preparación de ADN. 3. Aumente la fuerza iónica del tampón de reacción a 100-150 mM (siempre que la enzima no esté inhibida por un alto contenido de sal). 4. Disminuya el pH del tampón de reacción a pH 7,0. 5. Utilice Mg++ como catión divalente. P: ¿Los sitios de reconocimiento degenerados deben ser palindrómicos? R: La mayoría de los sitios de reconocimiento de enzimas de restricción son palindrómicos e incluyen solo pares de bases específicos (es decir, EcoRI reconoce GAATTC). Sin embargo, algunas enzimas tienen sitios degenerados, lo que significa que contienen uno o más pares de bases que no están específicamente definidos (es decir, BsrFI-v2 reconoce RCCGGY, donde R = A o G e Y = C o T). Para las enzimas degeneradas, cualquier base representada por el código de una sola letra puede estar presente en cualquier ubicación en el sitio de reconocimiento para que se produzca la escisión. Por ejemplo, BsrFI-v2 reconoce todas las siguientes secuencias: ACCGGC, ACCGGT, GCCGGC, GCCGGT. P: ¿Cómo se puede inactivar esta enzima? R: Para inactivar enzimas que no se pueden eliminar por calor, recomendamos una extracción con fenol seguida de una precipitación con etanol o una columna de centrifugación comercial diseñada para purificar ADN. P: ¿Tengo que preparar las digestivas con enzimas con certificación Time-Saver™ durante 5-15 minutos? ¿Puedo digerir durante más tiempo? R: Las enzimas Time-Saver™ de NEB tienen la ventaja de actuar rápidamente (5-15 minutos), pero también están diseñadas y certificadas para soportar digestores nocturnos sin degradar el ADN. P: ¿Es esta enzima sensible a la metilación de DAM, DCM o CpG de mamíferos? R: Sí. Esta enzima no puede cortar los sitios de reconocimiento en el ADNg de mamíferos que están bloqueados por algunas combinaciones de metilación de CpG superpuesta. Para obtener información actualizada sobre la sensibilidad a la metilación, visite Dam-DCM y metilación de CpG o REBASE. P: ¿Pueden darme más información sobre el cambio de BSA a albúmina recombinante (rAlbúmina) en los NEBuffers? A: NEB se complace en anunciar que hemos cambiado los tampones de reacción con BSA (NEBuffer 1.1, 2.1, 3.1 y CutSmart® Buffer) por tampones con albúmina recombinante (NEBuffer r1.1, r2.1, r3.1 y rCutSmart™ Buffer). También estamos en proceso de adaptar todas las formulaciones de enzimas de restricción para que contengan albúmina recombinante. Creemos que dejar de usar productos con ingredientes de origen animal es un paso en la dirección correcta y podemos ofrecer esta mejora al mismo precio.