Laboratorios biológicos de Nueva Inglaterra, R0559L, BsgI

BsgI se ha reformulado con albúmina recombinante (rAlbúmina) a partir del lote n.º 10201941. Categorías relacionadas Endonucleasas de restricción B,, Enzimas de restricción calificadas que ahorran tiempo Aplicaciones Clonación rápida: acelere sus flujos de trabajo de clonación con reactivos de NEB,, Especificación de digestión con enzimas de restricción Definición de unidad Una unidad se define como la cantidad de enzima necesaria para digerir 1 µg de ADN λ en 1 hora a 37 °C en un volumen total de 50 μl. Condiciones de reacción Tampón rCutSmart™ 1X Incubar a 37 °C Tampón rCutSmart™ 1X Acetato de potasio 50 mM Tris-acetato 20 mM Acetato de magnesio 10 mM Albúmina recombinante 100 µg/ml (pH 7,9 a 25 °C) Actividad en tampones NE Tampón NE™ r1.1: 25 % Tampón NE™ r2.1: 50 % Tampón NE™ r3.1: 25 % Tampón rCutSmart™: 100 % Compatibilidad del diluyente Diluyente B Tampón de almacenamiento NaCl 300 mM Tris-HCl 10 mM DTT EDTA 0,1 mM S-adenosilmetionina (SAM) 0,32 mM 500 µg/ml Albúmina recombinante 50% Glicerol pH 7,4 a 25 °C Inactivación por calor 65 °C durante 20 minutos Sensibilidad a la metilación dam metilación : No sensible dcm metilación: No sensible CpG metilación: No sensible Preguntas frecuentes P: ¿Por qué BsgI no corta bien? R: BsgI requiere 80 µM de SAM en la mezcla de reacción. La incubación sin SAM da como resultado una actividad del 25-50 %. El SAM debe ser fresco. Sugerimos preparar el SAM justo antes de usarlo e incluso dividirlo en alícuotas en la forma concentrada para que no tenga que sufrir demasiadas congelaciones y descongelaciones. Incluso a -70 °C solo dura unos seis meses. BsgI y SAM pierden actividad en las digestiones nocturnas, por lo que no se recomiendan. Es mejor agregar más unidades de BsgI y agregar una vez SAM fresco que hacer una digestión nocturna. La BsgI también es inhibida por nucleótidos y contaminantes del ADN. La diálisis por goteo del ADN puede aumentar la escisión. P: ¿Cuál es la actividad de la BsgI a 25 °C? R: La BsgI es 100 % activa a 25 °C. P: ¿Existen errores de secuencia conocidos en el sitio de reconocimiento en una base de datos? R: Sí. La BsgI corta el ADN phiX174; los informes de la ausencia de un sitio BsgI en ese ADN se han atribuido a un error de secuenciación. P: ¿Tengo que configurar las digestaciones con enzimas calificadas Time-Saver™ durante 5 a 15 minutos? ¿Puedo digerir durante más tiempo? R: Las enzimas Time-Saver™ de NEB tienen la ventaja de actuar rápidamente (5 a 15 minutos), pero también están diseñadas y calificadas para soportar digestores nocturnos sin degradación del ADN. P: Probé su enzima de restricción en el ADN sustrato recomendado por NEB y parece estar activa; sin embargo, no digiere mi ADN. ¿Cuál podría ser la razón? R: La calidad y la limpieza del ADN son factores importantes que pueden afectar la actividad enzimática. Las enzimas de restricción activas en el tampón rCutSmart®, pero no tan activas en el tampón NE r2.1 o r3.1 (nuestros tampones con mayor concentración de sal), pueden verse inhibidas por la sal presente en la reacción. Los procedimientos de purificación de ADN que utilizan columnas de centrifugación pueden generar soluciones de ADN con niveles significativos de sal que pueden pasar a la reacción e inhibir la actividad enzimática. Para evitar esto, recomendamos que la solución de ADN añadida a la reacción no supere el 25 % del volumen total de reacción. Esto se puede lograr ajustando el volumen total de reacción según corresponda. P: ¿Esta enzima es sensible a la metilación de CpG en dam, dcm o mamíferos? R: No. Esta enzima no es sensible a la metilación de CpG en dam, dcm o mamíferos. Para obtener información actualizada sobre la sensibilidad a la metilación, visite Dam-Dcm y metilación de CpG o REBASE. P: ¿BsgI requiere SAM para su actividad? R: Sí, la S-adenosilmetionina (SAM) es necesaria para una actividad óptima (la SAM se suministra en la formulación enzimática desde octubre de 2020). Si no está seguro de si la SAM está presente en la formulación enzimática y dispone de un vial de SAM de NEB, puede añadirla a la reacción según las directrices anteriores. P: ¿Podría darme más información sobre la transición de BSA a albúmina recombinante (rAlbúmina) en los tampones NE? R: NEB se complace en anunciar que hemos cambiado los tampones de reacción con BSA (NEBuffer 1.1, 2.1, 3.1 y CutSmart® Buffer) por tampones con albúmina recombinante (NEBuffer r1.1, r2.1, r3.1 y rCutSmart™ Buffer). También estamos en proceso de migrar todas las formulaciones de enzimas de restricción para que contengan rAlbúmina. Creemos que alejarnos de los productos que contienen ingredientes de origen animal es un paso en la dirección correcta y podemos ofrecer esta mejora al mismo precio.