Biolabs de Nueva Inglaterra, R0569S, Sapi

Aprenda sobre la fidelidad de la ligasa y supere los límites de las categorías relacionadas Endonucleasas de restricción S,, Enzimas de restricción calificadas que ahorran tiempo Aplicaciones Soluciones de automatización y clonación de alto rendimiento,, Ensamblaje NEBridge® Golden Gate,, Especificación de digestión con enzimas de restricción Definición de unidad Una unidad se define como la cantidad de enzima necesaria para digerir 1 µg de ADN λ en 1 hora a 37 °C en un volumen de reacción total de 50 μl. Condiciones de reacción Tampón rCutSmart™ 1X Incubar a 37 °C Tampón rCutSmart™ 1X Acetato de potasio 50 mM Tris-acetato 20 mM Acetato de magnesio 10 mM Albúmina recombinante 100 µg/ml (pH 7,9 a 25 °C) Actividad en tampones NE Tampón NE™ r1.1: 75 % Tampón NE™ r2.1: 50 % Tampón NE™ r3.1: <10 % Tampón rCutSmart™: 100 % Compatibilidad del diluyente Diluyente B Tampón de almacenamiento Tris-HCl 10 mM NaCl 300 mM DTT 1 mM EDTA 0,1 mM Albúmina recombinante 50 % Glicerol pH 7,4 @ 25 °C Inactivación por calor 65 °C durante 20 minutos Sensibilidad a la metilación dam metilación: No sensible dcm metilación: No sensible CpG metilación: No sensible Preguntas frecuentes P: ¿Por qué SapI no corta? R: A diferencia de la mayoría de las otras enzimas, SapI tiende a asentarse en el tubo. Mezcle con su pipeta antes de retirar del tubo para asegurar la digestión. P: ¿Qué secuencia reconoce SapI? R: GCTCTTC y su complemento GAAGAGC. P: ¿Se recomienda la digestión prolongada de SapI? R: La digestión prolongada no es beneficiosa porque la enzima no es estable en la reacción. P: ¿Se utiliza SapI para alguna técnica especial? R: El sitio SapI en pTYB1 y pTYB11 del sistema Impact-CN permite la clonación inmediatamente adyacente al sitio de escisión de la etiqueta de inteína; esto da como resultado la purificación de una proteína objetivo sin ningún residuo no nativo adicional unido a su terminal después de la escisión. P: ¿Cuál es la actividad de SapI a 25 °C? R: SapI tiene una actividad del 50-75 % a 25 °C. P: ¿Tengo que preparar las digestas con enzimas calificadas Time-Saver™ durante 5-15 minutos? ¿Puedo digerir durante más tiempo? R: Las enzimas Time-Saver™ de NEB tienen la ventaja de trabajar rápido (5-15 minutos), pero también están diseñadas y calificadas para soportar digestaciones durante la noche sin degradación del ADN. P: Probé su enzima de restricción en el ADN sustrato recomendado por NEB y parece estar activa; sin embargo, no digiere mi ADN. ¿Cuál podría ser la razón? R: La calidad y la limpieza del ADN son factores importantes que pueden afectar la actividad enzimática. Las enzimas de restricción activas en el tampón rCutSmart®, pero no tan activas en el tampón NE r2.1 o r3.1 (nuestros tampones con mayor concentración de sal), pueden ser inhibidas por la sal en la reacción. Los procedimientos de purificación de ADN que utilizan columnas de centrifugación pueden generar soluciones de ADN con niveles significativos de sal que pueden pasar a la reacción e inhibir la actividad enzimática. Para evitar esto, recomendamos que la solución de ADN añadida a la reacción no supere el 25 % del volumen total de reacción. Esto se puede lograr ajustando el volumen total de reacción según corresponda. P: ¿Qué enzimas de restricción NEB se suministran con el colorante de carga de gel morado (6X)? R: Todas las enzimas de restricción HF y la mayoría de las enzimas de restricción NEB sin HF se suministran con el colorante de carga de gel morado (6X). Las enzimas de restricción no HF que vienen suministradas con el tinte púrpura son: AatII AsiSI BsmBI-v2 EagI MboI NlaIII PvuI SmaI Acil AvrII BspHI EcoRI MboII NotI RsaI SpeI AfeI BamHI BsrGI EcoRV MluI NspI SacI StuI AflII BbsI ClaI Esp3I FseI MseI PacI SacII AgeI BglII DdeI HaeIII MspI PciI SalI XbaI AluI BsaI DpnI HindIII NcoI PmeI SapI XhoI ApaI BseYI DpnII HpaI NdeI PsiI-v2 SfaNI XmaI ApeKI BsiWI DraI KpnI NheI PstI SfiI XmnI AscI * Todas las enzimas de restricción HF también se suministran con tinte de carga en gel, morado (6X) P: ¿Esta enzima es sensible a ¿Metilación de CpG de dam, dcm o mamíferos? R: No. Esta enzima no es sensible a la metilación de CpG de dam, dcm ni mamíferos. Para obtener información actualizada sobre la sensibilidad a la metilación, visite Dam-Dcm y Metilación de CpG o REBASE. P: ¿Ofrece NEB enzimas de restricción sin BSA ni de origen animal para la linealización de plásmidos para el desarrollo de vacunas de ARNm? R: Sí, NEB ha formulado algunas enzimas de restricción (incluida BspQI, un isoesquizómero de SapI) sin componentes de origen animal y su formulación final no contiene BSA. Además, disponemos de varias enzimas de restricción sin BSA ni otros componentes de origen animal en su formulación final. Esta lista incluye: BbsI-HF BsaI-HFv2 BspQI, isoesquizómero de LguI, grado GMP* ahora disponible BspQI-HF ClaI HindIII-HF PacI SapI SpeI SwaI XbaI XhoI XmnI Se pueden formular otras enzimas a pedido. Consulte aquí. * “Grado GMP” y “grado GMP” son términos de marca que NEB usa para describir productos fabricados o terminados en las instalaciones de NEB en Rowley. Las instalaciones de Rowley fueron diseñadas para fabricar productos bajo controles de infraestructura y procesos más rigurosos para lograr especificaciones de producto y requisitos de los clientes más estrictos. Los productos fabricados en las instalaciones de NEB en Rowley se fabrican de conformidad con los estándares del sistema de gestión de calidad ISO 9001 e ISO 13485. Sin embargo, en este momento, NEB no fabrica ni vende productos conocidos como Ingredientes Farmacéuticos Activos (API), ni NEB fabrica sus productos de conformidad con todas las regulaciones actuales de Buenas Prácticas de Manufactura. P: ¿Podrían contarme más sobre la transición de BSA a albúmina recombinante (rAlbúmina) en los tampones NEB? R: En NEB nos complace anunciar que hemos cambiado los tampones de reacción con BSA (NEBuffer 1.1, 2.1, 3.1 y CutSmart®) por tampones con albúmina recombinante (NEBuffer r1.1, r2.1, r3.1 y rCutSmart™). También estamos en proceso de adaptar todas las formulaciones de enzimas de restricción para que contengan rAlbúmina. Creemos que dejar de usar productos de origen animal es un paso en la dirección correcta y podemos ofrecer esta mejora al mismo precio.