Laboratorios biológicos de Nueva Inglaterra, R0588S, FseI

Categorías relacionadas Endonucleasas de restricción CG,, Enzimas de restricción calificadas que ahorran tiempo Aplicaciones Clonación rápida: acelere sus flujos de trabajo de clonación con reactivos de NEB,, Definición de unidad de especificación de digestión con enzimas de restricción Una unidad se define como la cantidad de enzima necesaria para digerir 1 µg de ADN pBC4 en 1 hora a 37 °C en un volumen de reacción total de 50 μl. Condiciones de reacción Tampón rCutSmart™ 1X Incubar a 37 °C Tampón rCutSmart™ 1X Acetato de potasio 50 mM Tris-acetato 20 mM Acetato de magnesio 10 mM Albúmina recombinante 100 µg/ml (pH 7,9 a 25 °C) Actividad en tampones NE Tampón NE™ r1.1: 100 % Tampón NE™ r2.1: 75 % Tampón NE™ r3.1: <10 % Tampón rCutSmart™: 100 % Compatibilidad del diluyente Diluyente B Tampón de almacenamiento Tris-HCl 10 mM KCl 100 mM DTT 1 mM EDTA 0,1 mM Tween® 20 al 0,5 % IGEPAL® CA-630 al 0,5 % 50% glicerol pH 7,4 a 25 °C Inactivación por calor 65 °C durante 20 minutos Sensibilidad a la metilación dam metilación: No sensible dcm metilación: Deteriorada por algunas combinaciones de CpG superpuestos Metilación: Bloqueada Preguntas frecuentes P: ¿Puedo esperar ver pérdida de actividad si se almacena a -20 °C? R: Sí, la pérdida de actividad se puede ver en 6 meses cuando se almacena a -20 °C. Se recomienda el almacenamiento a -80 °C. P: ¿Tengo que configurar las digestiones con enzimas calificadas Time-Saver™ durante 5-15 minutos? ¿Puedo digerir por más tiempo? R: Las enzimas Time-Saver™ de NEB tienen el beneficio de trabajar rápido (5-15 minutos), pero también están diseñadas y calificadas para soportar digestiones durante la noche sin degradación del ADN. P: Probé su enzima de restricción en el ADN sustrato recomendado por NEB y parece estar activo, sin embargo, no digiere mi ADN. ¿Cuál podría ser la razón? R: La calidad y la limpieza del ADN son factores importantes que pueden afectar la actividad enzimática. Las enzimas de restricción activas en el tampón rCutSmart®, pero no tan activas en el tampón NE r2.1 o r3.1 (nuestros tampones con mayor concentración de sal), pueden verse inhibidas por la sal presente en la reacción. Los procedimientos de purificación de ADN que utilizan columnas de centrifugación pueden generar soluciones de ADN con niveles significativos de sal que pueden pasar a la reacción e inhibir la actividad enzimática. Para evitar esto, recomendamos que la solución de ADN añadida a la reacción no supere el 25 % del volumen total de reacción. Esto se puede lograr ajustando el volumen total de reacción según corresponda. P: ¿Qué enzimas de restricción NEB se suministran con el colorante de carga de gel morado (6X)? R: Todas las enzimas de restricción HF y la mayoría de las enzimas de restricción NEB sin HF se suministran con el colorante de carga de gel morado (6X). Las enzimas de restricción no HF que vienen suministradas con el tinte púrpura son: AatII AsiSI BsmBI-v2 EagI MboI NlaIII PvuI SmaI Acil AvrII BspHI EcoRI MboII NotI RsaI SpeI AfeI BamHI BsrGI EcoRV MluI NspI SacI StuI AflII BbsI ClaI Esp3I FseI MseI PacI SacII AgeI BglII DdeI HaeIII MspI PciI SalI XbaI AluI BsaI DpnI HindIII NcoI PmeI SapI XhoI ApaI BseYI DpnII HpaI NdeI PsiI-v2 SfaNI XmaI ApeKI BsiWI DraI KpnI NheI PstI SfiI XmnI AscI * Todas las enzimas de restricción HF también se suministran con tinte de carga en gel, morado (6X) P: ¿Esta enzima es sensible a ¿Metilación de DAM, DCM o CpG en mamíferos? R: Sí. Esta enzima no puede cortar los sitios de reconocimiento afectados por algunas combinaciones de metilación superpuesta de DCM o bloqueados por la metilación de CpG. Para obtener información actualizada sobre la sensibilidad a la metilación, visite Dam-DCM y metilación de CpG o REBASE. P: ¿Pueden darme más información sobre la transición de BSA a albúmina recombinante (rAlbúmina) en los tampones NEB? R: NEB se complace en anunciar que hemos cambiado los tampones de reacción con BSA (NEBuffer 1.1, 2.1, 3.1 y CutSmart® Buffer) por tampones con albúmina recombinante (NEBuffer r1.1, r2.1, r3.1 y rCutSmart™ Buffer). También estamos en proceso de migrar todas las formulaciones de enzimas de restricción para que contengan rAlbúmina. Creemos que dejar de usar productos de origen animal es un paso en la dirección correcta y podemos ofrecer esta mejora al mismo precio. P: En el caso de las enzimas almacenadas a -80 °C, ¿se ve afectada su actividad tras múltiples ciclos de congelación/descongelación? R: Las siguientes enzimas mantuvieron su actividad completa tras 10 ciclos de congelación/descongelación. Si necesita más de 10 ciclos de congelación/descongelación, recomendamos dividir la enzima en alícuotas más pequeñas y congelar cada alícuota a -80 °C. Cac8I EagI-HF I-SceI KasI NlaIII. Nota: FseI mantuvo su actividad completa solo durante 5 ciclos de congelación/descongelación.