Laboratorios biológicos de Nueva Inglaterra, R0619L, HpyCH4IV

Categorías relacionadas Endonucleasas de restricción HM,, Enzimas de restricción calificadas que ahorran tiempo Aplicaciones Clonación rápida: acelere sus flujos de trabajo de clonación con reactivos de NEB,, Definición de unidad de especificación de digestión con enzimas de restricción Una unidad se define como la cantidad de enzima necesaria para digerir 1 µg de ADN pUC19 en 1 hora a 37 °C en un volumen de reacción total de 50 μl. Condiciones de reacción Tampón rCutSmart™ 1X Incubar a 37 °C Tampón rCutSmart™ 1X Acetato de potasio 50 mM Tris-acetato 20 mM Acetato de magnesio 10 mM Albúmina recombinante 100 µg/ml (pH 7,9 a 25 °C) Actividad en tampones NE Tampón NE™ r1.1: 100 % Tampón NE™ r2.1: 50 % Tampón NE™ r3.1: 25 % Tampón rCutSmart™: 100 % Compatibilidad del diluyente Diluyente A Tampón de almacenamiento Tris-HCl 10 mM NaCl 100 mM DTT 1 mM 200 µg/ml BSA Glicerol al 50 % pH 7,4 a 25 °C Inactivación por calor 65 °C durante 20 minutos Sensibilidad a la metilación dam metilación: No sensible dcm metilación: No sensible CpG metilación: Bloqueada Preguntas frecuentes P: ¿Es HpyCH4IV un isoesquizómero de MaeII? R: Sí, reconoce la misma secuencia y se escinde en el mismo lugar. Ambos están bloqueados por la metilasa SssI (CG) (5-metil citosina). P: ¿Son TaiI y TscI isoesquizómeros de HpyCH4IV? R: TaiI y TscI son neoesquizómeros de HpyCH4IV. Reconocen el mismo sitio pero cortan en una ubicación diferente. TaiI está bloqueado por SssI y TscI no ha sido probado. P: ¿Se ve afectado HpyCH4IV por la metilación? R: Sí, está bloqueado por la 5-metil citosina que se puede encontrar en el ADN de los mamíferos. Para obtener información actualizada sobre la sensibilidad a la metilación, visite Dam-Dcm y metilación de CpG o REBASE. P: ¿Tengo que configurar las digestas con enzimas calificadas Time-Saver™ durante 5 a 15 minutos? ¿Puedo digerir durante más tiempo? R: Las enzimas Time-Saver™ de NEB tienen la ventaja de actuar rápidamente (5 a 15 minutos), pero también están diseñadas y calificadas para soportar digestaciones nocturnas sin degradación del ADN. P: Probé su enzima de restricción en el ADN sustrato recomendado por NEB y parece estar activa; sin embargo, no digiere mi ADN. ¿Cuál podría ser la razón? R: La calidad y la limpieza del ADN son factores importantes que pueden afectar la actividad enzimática. Las enzimas de restricción activas en el tampón rCutSmart®, pero no tan activas en el tampón NE r2.1 o r3.1 (nuestros tampones con mayor concentración de sal), pueden verse inhibidas por la sal en la reacción. Los procedimientos de purificación de ADN que utilizan columnas de centrifugación pueden generar soluciones de ADN con niveles significativos de sal que pueden transferirse a la reacción e inhibir la actividad enzimática. Para evitarlo, recomendamos que la solución de ADN añadida a la reacción no supere el 25 % del volumen total de reacción. Esto se puede lograr ajustando el volumen total de reacción según corresponda. P: ¿Pueden darme más información sobre la transición de BSA a albúmina recombinante (rAlbúmina) en los tampones NEB? R: NEB se complace en anunciar que hemos cambiado los tampones de reacción con BSA (NEBuffer 1.1, 2.1, 3.1 y CutSmart® Buffer) por tampones con albúmina recombinante (NEBuffer r1.1, r2.1, r3.1 y rCutSmart™ Buffer). También estamos en proceso de migrar todas las formulaciones de enzimas de restricción para que contengan rAlbúmina. Creemos que alejarnos de los productos que contienen ingredientes de origen animal es un paso en la dirección correcta y podemos ofrecer esta mejora al mismo precio.