Laboratorios biológicos de Nueva Inglaterra, R0628L, BmgBI

BmgBI ha sido reformulado con albúmina recombinante (rAlbúmina) a partir del lote n.º 10192520. Categorías relacionadas Endonucleasas de restricción B,, Enzimas de restricción calificadas que ahorran tiempo Aplicaciones Clonación rápida: acelere sus flujos de trabajo de clonación con reactivos de NEB,, Definición de unidad de especificación de digestión con enzimas de restricción Una unidad se define como la cantidad de enzima necesaria para digerir 1 µg de ADN λ en 1 hora a 37 °C en un volumen de reacción total de 50 μl. Condiciones de reacción 1X NEBuffer™ r3.1 Incubar a 37 °C 1X NEBuffer™ r3.1 100 mM NaCl 50 mM Tris-HCl 10 mM MgCl2 100 µg/ml Albúmina recombinante (pH 7,9 a 25 °C) Actividad en NEBuffers NEBuffer™ r1.1: <10 % NEBuffer™ r2.1: 10 % NEBuffer™ r3.1: 100 % Tampón rCutSmart™: 10 % Compatibilidad del diluyente Diluyente B Tampón de almacenamiento 10 mM Tris-HCl 200 mM NaCl 1 mM DTT 0,1 mM EDTA 200 µg/ml Albúmina recombinante 50 % Glicerol pH 7,4 a Inactivación por calor a 25 °C a 65 °C durante 20 minutos Sensibilidad a la metilación Metilación en dique: No sensible Metilación en dcm: No sensible Metilación en CpG: Bloqueada Preguntas frecuentes P: ¿Qué es la actividad estrella y cómo se puede evitar? R: Se ha demostrado que, en condiciones extremas no estándar, las endonucleasas de restricción son capaces de escindir secuencias que son similares, pero no idénticas, a su secuencia de reconocimiento definida. Esta especificidad alterada o relajada se ha denominado actividad "estrella". Se ha sugerido que la actividad estrella puede ser una propiedad general de las endonucleasas de restricción y que cualquier endonucleasa de restricción puede ser capaz de escindir sitios no canónicos en ciertas condiciones extremas. La manera en que se altera la especificidad de una enzima depende de la enzima y de las condiciones empleadas para inducir la actividad estrella. Los tipos más comunes de actividad alterada son las sustituciones de bases individuales, el truncamiento de las bases externas en la secuencia de reconocimiento y el mellado de cadena sencilla. La actividad estrella es completamente controlable en la gran mayoría de los casos y generalmente no es una preocupación cuando se realizan digestas de endonucleasas de restricción. Las enzimas de New England Biolabs no exhibirán actividad estrella cuando se usen bajo las condiciones recomendadas en sus NEBuffers suministrados. A continuación se enumeran las condiciones de reacción que se sabe que inducen o inhiben la actividad estrella. Condiciones que contribuyen a la actividad estrella 1. Alta concentración de glicerol [> 5% v/v] 2. Alta proporción de unidades a µg de ADN [varía con cada enzima, usualmente >100 unidades/µg] 3. Baja fuerza iónica [< 25 mM] 4. Alto pH [> pH 8.0] 5. Presencia de solventes orgánicos [DMSO, etanol, etilenglicol, dimetilacetamida, dimetilformamida, sulfalano] 6. Sustitución de Mg++ con otros cationes divalentes [Mn++, Cu++, Co++, Zn++] Inhibición de la actividad estrella Si le preocupa la actividad estrella, le recomendamos las siguientes pautas. 1. Use la menor cantidad de unidades posible para lograr una digestión completa. Esto evita la sobredigestión y reduce la concentración final de glicerol en la reacción. 2. Asegúrese de que la reacción esté libre de cualquier solvente orgánico como alcoholes que puedan estar presentes en la preparación de ADN. 3. Aumente la fuerza iónica del tampón de reacción a 100-150 mM (siempre que la enzima no sea inhibida por un alto contenido de sal). 4. Disminuya el pH del tampón de reacción a pH 7.0. 5. Use Mg++ como catión divalente. P: ¿Tengo que configurar las digestaciones con enzimas calificadas Time-Saver™ durante 5-15 minutos? ¿Puedo digerir por más tiempo? R: Las enzimas Time-Saver™ de NEB tienen la ventaja de trabajar rápido (5-15 minutos), pero también están diseñadas y calificadas para soportar digestaciones nocturnas sin degradación del ADN. P: ¿Esta enzima es sensible a la metilación de CpG de DAM, DCM o mamíferos? R: Sí. Esta enzima no puede cortar los sitios de reconocimiento en el ADNg de mamíferos que están bloqueados por la metilación de CpG. Para obtener información actualizada sobre la sensibilidad a la metilación, visite Dam-Dcm y metilación de CpG o REBASE. P: ¿Pueden darme más información sobre la transición de BSA a albúmina recombinante (albúmina recombinante) en los tampones NEB? R: En NEB nos complace anunciar que hemos cambiado los tampones de reacción con BSA (NEBuffer 1.1, 2.1, 3.1 y CutSmart®) por tampones con albúmina recombinante (NEBuffer r1.1, r2.1, r3.1 y rCutSmart™). También estamos en proceso de adaptar todas las formulaciones de enzimas de restricción para que contengan albúmina recombinante. Creemos que dejar de usar productos con ingredientes de origen animal es un paso en la dirección correcta y podemos ofrecer esta mejora al mismo precio.