Laboratorios Biológicos de Nueva Inglaterra, R0637S, MmeI

MmeI se ha reformulado con albúmina recombinante (rAlbúmina) a partir del lote n.º 10263881. Categorías relacionadas Endonucleasas de restricción HM,, Enzimas de restricción calificadas que ahorran tiempo Aplicaciones Especificación de digestión con enzimas de restricción Definición de unidad Una unidad se define como la cantidad de MmeI necesaria para digerir 1 µg de ADN ΦX174 RF I en 1 hora a 37 °C en 50 μl de tampón de reacción. Condiciones de reacción Tampón rCutSmart™ 1X Incubar a 37 °C Tampón rCutSmart™ 1X Acetato de potasio 50 mM Tris-acetato 20 mM Acetato de magnesio 10 mM Albúmina recombinante 100 µg/ml (pH 7,9 a 25 °C) Actividad en tampones NE Tampón NE™ r1.1: 50 % Tampón NE™ r2.1: 100 % Tampón NE™ r3.1: 50 % Tampón rCutSmart™: 100 % Compatibilidad del diluyente Diluyente B Tampón de almacenamiento Tris-HCl 10 mM NaCl 300 mM EDTA 0,1 mM 500 µg/ml Albúmina recombinante 50 % Glicerol 0,32 mM S-adenosilmetionina (SAM) 1 mM DTT pH 7,4 a 25 °C Inactivación por calor 65 °C durante 20 minutos Sensibilidad a la metilación Metilación en presa: no sensible Metilación en dcm: no sensible Metilación en CpG: bloqueada por superposición Preguntas frecuentes P: ¿Existe alguna variabilidad en la distancia de corte desde el sitio de corte de MmeI, que se indica como 20/18? R: Es útil pensar en MmeI como la colocación de la endonucleasa a una distancia (relativamente) fija del sitio de reconocimiento, en lugar de que la enzima cuente las bases entre el sitio de reconocimiento y la posición de corte. La observación es que MmeI corta predominantemente a 20/18 y 21/19, con una proporción de aproximadamente 60 %/40 %. También hay un corte menor a 19/17 (aproximadamente un pequeño porcentaje). Los sitios individuales pueden cortarse prácticamente a la misma distancia o a una mezcla de distancias (20/18 y 21/19); creemos que esto depende de la estructura del ADN entre el sitio de reconocimiento y el sitio de corte. P: Observo una digestión parcial al usar MmeI. ¿Cuál podría ser la razón? R: Hay varias razones por las que MmeI podría no cortar completamente: 1. MmeI es sensible a la sal en la reacción y cualquier residuo de sal de una preparación de ADN puede inhibir la enzima. Pruebe la reacción en un ADN comercial para determinar si este es el problema. 2. MmeI requiere SAM para una escisión eficiente, y SAM es extremadamente lábil. Intente usar un tubo nuevo de SAM, así como ADN comercial, para determinar si este es el problema. 3. MmeI no tiene mucha renovación como enzima, a diferencia de las enzimas de restricción de tipo IIP comunes. Por lo tanto, es importante tener una proporción 1:1 de moléculas de MmeI por el número de sitios a cortar en la reacción. Esto puede ser particularmente importante para ADN cortos, ya que 1 microgramo de un producto de PCR de 100 pb que contiene un solo sitio MmeI representa aproximadamente 10 veces más sitios por microgramo que el sustrato PhiX174 utilizado para la definición de la unidad MmeI. 4. MmeI requiere dos sitios de unión para una escisión eficiente, y la digestión de plásmidos con un solo sitio resulta en una digestión parcial de aproximadamente el 70% de corte. Como MmeI requiere 2 sitios, la adición de un oligo de doble cadena que contenga un sitio MmeI puede ayudar a mejorar la escisión. El oligo ds debe tener de 8 a 12 pb de secuencia flanqueante a cada lado de la secuencia de reconocimiento de MmeI, pero no necesita extenderse completamente hasta el punto de escisión. P: ¿MmeI es sensible a la metilación de CpG? A: MmeI se bloquea por metilación de CpG superpuesta si la C central, o la C 3', va seguida de una G, lo que resulta en la metilación de CpG. Por ejemplo, la secuencia TCCGAC o la secuencia TCCRACG no serán cortadas por MmeI si la modificación de CpG metila el residuo de citosina subrayado. Para obtener información actualizada sobre las sensibilidades de metilación, visite Dam-Dcm y metilación de CpG o REBASE. P: ¿Por qué un sitio MmeI escindido puede religar pero no volver a cortarse? R: MmeI es una enzima inusual, ya que tiene propiedades tanto de restricción como de metilación. Debido a que la escisión del ADN no rompe el sitio de reconocimiento, la enzima puede metilar su sitio de reconocimiento después de la escisión. Una vez que el sitio está metilado, no puede cortarse posteriormente después de ser ligado. P: ¿El corte de MmeI es exacto o el espaciado es variable? R: MmeI corta predominantemente en 20/18, pero ocasionalmente puede cortar una base más o más cerca del sitio de reconocimiento en 21/19 o 19/17. P: ¿Tengo que configurar las digestas con enzimas calificadas Time-Saver™ durante 5-15 minutos? ¿Puedo digerir más tiempo? R: Las enzimas Time-Saver™ de NEB tienen la ventaja de actuar rápidamente (5-15 minutos), pero también están diseñadas y calificadas para soportar digestaciones nocturnas sin degradación del ADN. P: Probé su enzima de restricción en el ADN sustrato recomendado por NEB y parece estar activa; sin embargo, no digiere mi ADN. ¿Cuál podría ser la razón? R: La calidad y la limpieza del ADN son factores importantes que pueden afectar la actividad enzimática. Las enzimas de restricción activas en el tampón rCutSmart®, pero no tan activas en el tampón NE r2.1 o r3.1 (nuestros tampones con mayor concentración de sal), pueden ser inhibidas por la sal en la reacción. Los procedimientos de purificación de ADN que utilizan columnas de centrifugación pueden generar soluciones de ADN con niveles significativos de sal que pueden transferirse a la reacción e inhibir la actividad enzimática. Para evitarlo, recomendamos que la solución de ADN añadida a la reacción no supere el 25 % del volumen total de reacción. Esto se puede lograr ajustando el volumen total de reacción según corresponda. P: ¿Mejorará la digestión la incubación durante la noche? R: No es necesario digerir MmeI durante la noche, ya que la escisión completa se produce en 15 minutos. Las incubaciones prolongadas generalmente no ayudan a lograr un corte completo, ya que la enzima puede metilar su sitio con el tiempo, lo que impedirá la escisión. P: ¿Requiere MmeI SAM para su actividad? R: Sí, la S-adenosilmetionina (SAM) es necesaria para una actividad óptima (SAM se suministra en la formulación enzimática a partir de octubre de 2020). Si no está seguro de si SAM está presente en la formulación enzimática y dispone de un vial de SAM de NEB, puede añadir SAM a la reacción según las directrices anteriores. P: ¿Podrían contarme más sobre la transición de BSA a albúmina recombinante (rAlbúmina) en los tampones NEB? R: En NEB nos complace anunciar que hemos cambiado los tampones de reacción con BSA (NEBuffer 1.1, 2.1, 3.1 y CutSmart®) por tampones con albúmina recombinante (NEBuffer r1.1, r2.1, r3.1 y rCutSmart™). También estamos en proceso de adaptar todas las formulaciones de enzimas de restricción para que contengan rAlbúmina. Creemos que dejar de usar productos de origen animal es un paso en la dirección correcta y podemos ofrecer esta mejora al mismo precio.