Laboratorios biológicos de Nueva Inglaterra, R0652L, AfeI

AfeI se ha reformulado con albúmina recombinante (rAlbúmina) a partir del lote n.º 10180738. Categorías relacionadas Endonucleasas de restricción: A Aplicaciones Digestión con enzimas de restricción Unidad de especificación Definición Una unidad se define como la cantidad de enzima necesaria para digerir 1 µg de ADN pXba en 1 hora a 37 °C en un volumen de reacción total de 50 μl. Condiciones de reacción Tampón rCutSmart™ 1X Incubar a 37 °C Tampón rCutSmart™ 1X Acetato de potasio 50 mM Tris-acetato 20 mM Acetato de magnesio 10 mM Albúmina recombinante 100 µg/ml (pH 7,9 a 25 °C) Actividad en tampones NE Tampón NE™ r1.1: 25 % Tampón NE™ r2.1: 100 % Tampón NE™ r3.1: 25 % Tampón rCutSmart™: 100 % Compatibilidad del diluyente Diluyente B Tampón de almacenamiento Tris-HCl 10 mM NaCl 300 mM EDTA 0,1 mM Albúmina recombinante 50 % Glicerol DTT 1 mM pH 7,4 a 25 °C Inactivación por calor 65 °C durante 20 minutos Sensibilidad a la metilación Metilación de dam: no sensible Metilación de dcm: no sensible Metilación de CpG: bloqueada Preguntas frecuentes P: ¿La actividad de AfeI es sensible a la metilación de dam, dcm o CpG de mamíferos? R: Sí. AfeI no puede cortar sitios de reconocimiento en gDNA de mamíferos que contienen metilación de CpG. Para obtener información actualizada sobre las sensibilidades de metilación, visite Dam-Dcm y metilación de CpG o REBASE. P: ¿Cuántos pares de bases se deben agregar al final de un cebador de PCR junto al sitio de reconocimiento de AfeI para garantizar que AfeI corte correctamente? R: Se recomienda la adición de 6 pares de bases. P: ¿AfeI tiene neoesquizómeros? R: No. Para obtener la información más actualizada sobre isoesquizómeros/neoesquizómeros, consulte REBASE. P: Probé su enzima de restricción en el sustrato de ADN recomendado por NEB y parece estar activa; sin embargo, no digiere mi ADN. ¿Cuál podría ser la razón? R: La calidad y la limpieza del ADN son factores importantes que pueden afectar la actividad enzimática. Las enzimas de restricción activas en el tampón rCutSmart®, pero no tan activas en el tampón NE r2.1 o r3.1 (nuestros tampones con mayor concentración de sal), pueden verse inhibidas por la sal presente en la reacción. Los procedimientos de purificación de ADN que utilizan columnas de centrifugación pueden generar soluciones de ADN con niveles significativos de sal que pueden pasar a la reacción e inhibir la actividad enzimática. Para evitar esto, recomendamos que la solución de ADN añadida a la reacción no supere el 25 % del volumen total de la reacción. Esto se puede lograr ajustando el volumen total de la reacción según corresponda. P: ¿Qué enzimas de restricción de NEB se suministran con el colorante de carga de gel morado (6X)? R: Todas las enzimas de restricción con HF y la mayoría de las enzimas de restricción de NEB sin HF se suministran con el colorante de carga de gel morado (6X). Las enzimas de restricción no HF que vienen suministradas con el tinte púrpura son: AatII AsiSI BsmBI-v2 EagI MboI NlaIII PvuI SmaI Acil AvrII BspHI EcoRI MboII NotI RsaI SpeI AfeI BamHI BsrGI EcoRV MluI NspI SacI StuI AflII BbsI ClaI Esp3I FseI MseI PacI SacII AgeI BglII DdeI HaeIII MspI PciI SalI XbaI AluI BsaI DpnI HindIII NcoI PmeI SapI XhoI ApaI BseYI DpnII HpaI NdeI PsiI-v2 SfaNI XmaI ApeKI BsiWI DraI KpnI NheI PstI SfiI XmnI AscI * Todas las enzimas de restricción HF también se suministran con tinte de carga en gel, morado (6X) P: ¿Puedes contarme más? ¿Sobre el cambio de BSA a albúmina recombinante (rAlbúmina) en los NEBuffers? R: En NEB nos complace anunciar que hemos cambiado los tampones de reacción con BSA (NEBuffer 1.1, 2.1, 3.1 y CutSmart® Buffer) por tampones con albúmina recombinante (NEBuffer r1.1, r2.1, r3.1 y rCutSmart™ Buffer). También estamos en proceso de cambiar todas las formulaciones de enzimas de restricción para que contengan rAlbúmina. Creemos que dejar de usar productos de origen animal es un paso en la dirección correcta y podemos ofrecer esta mejora al mismo precio. P: ¿Se puede almacenar el colorante de carga de gel, púrpura 6X (B7024) a bajas temperaturas? R: La temperatura de almacenamiento recomendada para el colorante de carga de gel, púrpura 6X, es temperatura ambiente (25 °C). Comúnmente, la SDS puede precipitar de la solución cuando el colorante se almacena a bajas temperaturas. Este ligero precipitado puede disiparse dejando el vial a temperatura ambiente durante una hora o calentándolo suavemente durante 10 minutos. Mezcle el vial varias veces antes de usarlo para homogeneizar la solución.