Laboratorios biológicos de Nueva Inglaterra, R0655S, PciI

PciI se ha reformulado con albúmina recombinante (rAlbúmina) a partir del lote n.º 10161946. Categorías relacionadas Endonucleasas de restricción Aplicaciones de PR Digestión con enzimas de restricción Unidad de especificación Definición Una unidad se define como la cantidad de enzima necesaria para digerir 1 µg de ADN pXba en 1 hora a 37 °C en un volumen de reacción total de 50 μl. Condiciones de reacción 1X NEBuffer™ r3.1 Incubar a 37 °C 1X NEBuffer™ r3.1 100 mM NaCl 50 mM Tris-HCl 10 mM MgCl2 100 µg/ml Albúmina recombinante (pH 7,9 a 25 °C) Actividad en NEBuffers NEBuffer™ r1.1: 50 % NEBuffer™ r2.1: 75 % NEBuffer™ r3.1: 100 % Tampón rCutSmart™: 50 % Compatibilidad del diluyente Diluyente B Tampón de almacenamiento 10 mM Tris-HCl 300 mM NaCl 1 mM DTT 0,1 mM EDTA 500 µg/ml Albúmina recombinante 50 % Glicerol pH 7,4 a 25 °C Inactivación por calor 80 °C durante 20 minutos Sensibilidad a la metilación dam metilación: No sensible metilación dcm: No sensible Metilación CpG: No sensible Preguntas frecuentes P: ¿Cómo puedo buscar una enzima de restricción por secuencia, saliente o nombre? R: El buscador de enzimas, una nueva herramienta disponible en nuestro sitio web en la barra lateral bajo "Herramientas favoritas", se puede utilizar para buscar enzimas de restricción por nombre, secuencia, saliente o tipo. Las enzimas NEB incluyen íconos de propiedades enzimáticas y se muestran como enlaces. P: ¿Cómo debo detener mi digestión de restricción? R: Si no se planean más manipulaciones del ADN digerido, la reacción se puede terminar agregando una solución de parada. En NEB, utilizamos la siguiente solución de parada: 50% glicerol, 50 mM EDTA (pH 8,0) y 0,05% azul de bromofenol (reacción de 10 μl / 50 μl). Si se requieren más manipulaciones del ADN digerido, la inactivación por calor (elevar la temperatura a 65 u 80 °C durante 20 minutos) es el método más sencillo para detener una reacción. Dado que este método no funciona con todas las enzimas de restricción, consulte la información del catálogo de la(s) enzima(s) que esté utilizando. La extracción con fenol/cloroformo es otro método para inactivar una enzima de restricción. P: ¿Qué tan estable es una enzima de restricción en particular? R: Todas las enzimas se analizan para determinar su actividad cada 3 a 6 meses; la fecha del ensayo más reciente se encuentra en la etiqueta adherida a cada vial de enzima. Tras treinta años de experiencia con enzimas de restricción, hemos descubierto que la mayoría son muy estables cuando se almacenan a -20 °C en el tampón de almacenamiento recomendado. La exposición a temperaturas superiores a -20 °C debe minimizarse siempre que sea posible. P: ¿Cuándo debo elegir la versión HF de una enzima? R: La versión HF de la enzima tiene la misma especificidad de escisión que la enzima de tipo salvaje y debe elegirse si la actividad estrella es preocupante o si el tampón recomendado es más conveniente para la digestión doble u otro protocolo de varios pasos. No hay ninguna desventaja en usar la versión HF. P: ¿Cuándo es preocupante la actividad estrella? R: La actividad estrella es preocupante si las bandas adicionales pueden causar una interpretación errónea de los resultados en los procedimientos de genotipado y análisis mutacional. El diseño experimental puede promover la actividad estrella. Los volúmenes de reacción pequeños tienen mayor probabilidad de contener concentraciones de glicerol del 5% o superiores, una condición que se sabe que aumenta la actividad estrella. Se produce una concentración de glicerol del 5% al ​​configurar una digestión doble en una reacción de 20 µl utilizando 1 µl de cada enzima. Las digestas nocturnas tienen mayor probabilidad de generar actividad estrella. Para obtener consejos sobre cómo evitar la actividad estrella, haga clic aquí. P: ¿Cómo debo configurar una digestión de restricción? R: La mayoría de los investigadores siguen la regla general de que 10 unidades de endonucleasa de restricción son suficientes para compensar la variabilidad en la fuente, cantidad y pureza del ADN. Generalmente, se añade 1 μl de enzima a 1 μg de ADN purificado en un volumen final de 50 μl del tampón NE 1X adecuado, seguido de una incubación de 1 hora a la temperatura recomendada. Si se utiliza un exceso de enzima, a menudo se puede reducir la duración de la incubación para ahorrar tiempo. Como alternativa, se puede digerir productivamente con menos unidades de enzima durante hasta 16 horas con muchas enzimas de restricción. Para mantener la concentración de glicerol por debajo del 5 % en una reacción, la enzima de restricción, que se suministra en glicerol al 50 %, no debe superar el 10 % del volumen total de la reacción. Un elemento extremadamente importante, aunque a menudo pasado por alto, para una digestión de restricción exitosa es la mezcla. La reacción debe estar completamente mezclada para lograr una digestión completa. Recomendamos pipetear suavemente la mezcla de reacción hacia arriba y hacia abajo o agitar el tubo de reacción. A continuación, realice una centrifugación rápida ("a toque") en una microcentrífuga. No agite la reacción en vórtex. P: No observo ninguna división después de mi digestión de restricción. ¿Qué factores pueden interferir con la escisión? R: La preparación del ADN que se va a escindir debe estar libre de contaminantes como fenol, cloroformo, alcohol, EDTA, detergentes o exceso de sales, ya que todos ellos pueden interferir con la actividad de las enzimas de restricción. La metilación del ADN también es un elemento importante de una digestión de restricción. Si tiene dificultades para escindir el sustrato de ADN, le recomendamos las siguientes reacciones de control. Incube el ADN experimental sin la enzima de restricción (la degradación del ADN indica contaminación en la preparación de ADN o el tampón de reacción) y el ADN de control (ADN con múltiples sitios conocidos para la enzima, p. ej., ADN lambda o de adenovirus-2) con la enzima de restricción para determinar con mayor precisión si la reacción se completó. Si el ADN de control se escinde y el ADN experimental resiste la escisión, se pueden mezclar ambos ADN para determinar si hay un inhibidor presente en la muestra experimental. Si hay un inhibidor (a menudo sal, EDTA o fenol), el ADN de control no se cortará después de mezclarlo. P: ¿Cómo puedo generar un mapa de sitios de enzimas de restricción para mi secuencia? R: NEBcutter®, un programa informático para el mapeo de sitios de enzimas de restricción, está disponible en el sitio web de NEB, en la barra lateral, bajo "Herramientas favoritas". El programa acepta secuencias recuperadas de un archivo local o de GenBank. También acepta una secuencia de entrada pegada en un campo designado. Al presentar una secuencia, NEBcutter encontrará los marcos de lectura abiertos más grandes dentro de la secuencia e indicará las enzimas de restricción que podrían usarse para escindir el gen. También localiza las posiciones de todas las enzimas de restricción que solo cortan una vez dentro de la secuencia seleccionada. NEBcutter también es plenamente consciente de la información sobre la sensibilidad a la metilación de las enzimas de restricción y alerta al usuario sobre la metilación superpuesta por dam, dcm, etc. P: ¿Qué información hay disponible en la Base de Datos de Enzimas de Restricción (REBASE)? R: La Base de Datos de Enzimas de Restricción (REBASE), que se encuentra en la barra lateral, bajo "Herramientas favoritas" de nuestro sitio web, es una base de datos completa con información sobre enzimas de restricción y proteínas relacionadas. Contiene referencias publicadas y no publicadas, sitios de reconocimiento y escisión, isoesquizómeros, disponibilidad comercial, sensibilidad a la metilación, datos de cristales y secuencias. También se incluyen ADN metiltransferasas, endonucleasas homing, enzimas de mellado, subunidades de especificidad y proteínas de control. Más recientemente, se han añadido posibles ADN metiltransferasas y enzimas de restricción, como se predijo a partir del análisis de secuencias genómicas. P: ¿Se recomienda la digestión prolongada (tiempos de incubación > 1 hora)? R: La definición de unidad de nuestras enzimas de restricción se basa en una incubación de 1 hora. El tiempo de incubación puede acortarse si se añaden unidades adicionales de enzima de restricción a la reacción. Por el contrario, a menudo se utilizan tiempos de incubación más largos para permitir que una reacción se complete con menos unidades de enzima. Esto depende de cuánto tiempo una enzima en particular puede sobrevivir (mantener la actividad) en una reacción. Algunas enzimas sobreviven durante largos períodos (> 16 horas), mientras que otras sobreviven solo una hora o menos en una reacción. Para cada enzima de restricción, informamos el número mínimo de unidades (1,0, 0,5, 0,25 o 0,13) necesarias para digerir 1 µg de ADN sustrato en 16 horas. Las enzimas que requieren menos de 1 unidad se pueden usar en concentraciones más bajas para tiempos de incubación más prolongados. Tenga en cuenta que los sustratos de ADN se digieren a velocidades variables, el número real de unidades necesarias para una digestión completa cambiará de sustrato a sustrato. Verifique la información individual de la enzima de restricción antes de extender los tiempos de reacción, ya que las que muestran actividad estrella se deben usar en las condiciones recomendadas para inhibir la escisión no canónica. P: ¿Los sitios de reconocimiento degenerados necesitan ser palindrómicos? R: La mayoría de los sitios de reconocimiento de enzimas de restricción son palindrómicos e incluyen solo pares de bases específicos (es decir, EcoRI reconoce GAATTC). Sin embargo, algunas enzimas tienen sitios degenerados, lo que significa que contienen uno o más pares de bases que no están específicamente definidos (es decir, BsrFI-v2 reconoce RCCGGY, donde R = A o G e Y = C o T). En el caso de las enzimas degeneradas, cualquier base representada por el código de una sola letra puede estar presente en cualquier ubicación del sitio de reconocimiento para que se produzca la escisión. Por ejemplo, BsrFI-v2 reconoce todas las siguientes secuencias: ACCGGC, ACCGGT, GCCGGC, GCCGGT. P: ¿Qué significa la certificación Time-Saver™? R: Las enzimas con certificación Time-Saver digieren el sustrato de ensayo unitario en 5-15 minutos en las condiciones de reacción recomendadas y también pueden utilizarse de forma segura en digestores nocturnos. P: ¿Qué enzimas de restricción NEB se suministran con el colorante de carga de gel morado (6X)? R: Todas las enzimas de restricción HF y la mayoría de las enzimas de restricción NEB sin HF se suministran con el colorante de carga de gel morado (6X). Las enzimas de restricción no HF que vienen suministradas con el tinte púrpura son: AatII AsiSI BsmBI-v2 EagI MboI NlaIII PvuI SmaI Acil AvrII BspHI EcoRI MboII NotI RsaI SpeI AfeI BamHI BsrGI EcoRV MluI NspI SacI StuI AflII BbsI ClaI Esp3I FseI MseI PacI SacII AgeI BglII DdeI HaeIII MspI PciI SalI XbaI AluI BsaI DpnI HindIII NcoI PmeI SapI XhoI ApaI BseYI DpnII HpaI NdeI PsiI-v2 SfaNI XmaI ApeKI BsiWI DraI KpnI NheI PstI SfiI XmnI AscI * Todas las enzimas de restricción HF también se suministran con tinte de carga en gel, morado (6X) P: ¿Esta enzima es sensible a ¿Metilación de dam, dcm o CpG de mamíferos? R: No. Esta enzima no es sensible a la metilación de dam, dcm ni a la de CpG de mamíferos. Para obtener información actualizada sobre la sensibilidad a la metilación, visite Dam-Dcm y metilación de CpG o REBASE. P: ¿Podrían darme más información sobre la transición de BSA a albúmina recombinante (rAlbúmina) en los tampones NEB? R: NEB se complace en anunciar que hemos cambiado los tampones de reacción con BSA (NEBuffer 1.1, 2.1, 3.1 y CutSmart®) por tampones con albúmina recombinante (NEBuffer r1.1, r2.1, r3.1 y rCutSmart™). También estamos en proceso de migrar todas las formulaciones de enzimas de restricción para que contengan rAlbúmina. Creemos que dejar de usar productos de origen animal es un paso en la dirección correcta y podemos ofrecer esta mejora al mismo precio. P: ¿Se puede almacenar el colorante de carga en gel, morado 6X (B7024) a bajas temperaturas? R: La temperatura de almacenamiento recomendada para el colorante de carga en gel, morado 6X, es la temperatura ambiente (25 °C). Es común que la SDS se precipite de la solución cuando el colorante se almacena a bajas temperaturas. Este ligero precipitado se puede disipar dejando el vial a temperatura ambiente durante una hora o calentándolo suavemente durante 10 minutos. Mezcle el vial varias veces antes de usarlo para homogeneizar la solución.