Laboratorios biológicos de Nueva Inglaterra, R0661S, MspJI

Definición de la unidad de especificación de digestión con enzimas de restricción Una unidad se define como la cantidad de enzima necesaria para digerir 1 µg de ADN pBR322 (dcm + ) en 1 hora a 37 °C en un volumen de reacción total de 50 μl. Condiciones de reacción Suplemento de tampón rCutSmart™ 1X con solución activadora de enzimas 1X Incubar a 37 °C Tampón rCutSmart™ 1X Acetato de potasio 50 mM Tris-acetato 20 mM Acetato de magnesio 10 mM Albúmina recombinante 100 µg/ml (pH 7,9 a 25 °C) Actividad en tampones NE Tampón NE™ r1.1: <10 % Tampón NE™ r2.1: <10 % Tampón NE™ r3.1: <10 % Tampón rCutSmart™: 100 % Compatibilidad del diluyente Diluyente B Tampón de almacenamiento Tris-HCl 10 mM NaCl 300 mM DTT 1 mM EDTA 0,1 mM 500 µg/ml BSA 50 % Glicerol pH 7,4 a 25 °C Inactivación por calor 65 °C durante 20 minutos Sensibilidad a la metilación Metilación en dam: no sensible Metilación en dcm: no sensible Metilación en CpG: no sensible Preguntas frecuentes P: ¿Cómo se ha utilizado MspJI en estudios epigenéticos? R: Esta enzima se ha utilizado para análisis epigenéticos en los que el ADN diana que contiene sitios CpG metilados en ambas cadenas se escinde mediante MspJI para generar fragmentos de 32 pb que contienen los sitios CpG metilados. Los fragmentos aislados de 32 pb se pueden secuenciar para revelar sitios de modificación de 5-mC (Cohen-Karni et al., (2011) PNAS 108: 11040-11045). P: ¿Cómo puedo minimizar la actividad fuera del objetivo o la actividad estrella? R: La actividad estrella, incluida la digestión de sustratos de ADN no metilados, puede resultar de condiciones de reacción no óptimas, como un tiempo de digestión prolongado, una concentración alta de enzima o activador o una concentración de glicerol > 5 %. Puede ser necesario optimizar la cantidad de enzima necesaria para lograr un corte específico eficiente, evitando la actividad estrella, para cada sustrato de ADN. P: ¿Debo agregar más MspJI para obtener más corte? R: No, no necesariamente. A diferencia de muchas enzimas de restricción comunes, el uso de un exceso de MspJI inhibe la escisión. Puede ser necesario optimizar la cantidad de enzima necesaria para una digestión completa para cada sustrato de ADN. P: ¿Es esta enzima sensible a la metilación de CpG de DAM, DCM o mamíferos? R: No. Esta enzima no es sensible a la metilación de CpG de DAM, DCM o mamíferos. Para obtener información actualizada sobre la sensibilidad a la metilación, visite Dam-DCM y metilación de CpG o REBASE. P: ¿Podrían contarme más sobre la transición de BSA a albúmina recombinante (rAlbúmina) en los tampones NEB? R: En NEB nos complace anunciar la transición de los tampones de reacción con BSA (NEBuffer 1.1, 2.1, 3.1 y CutSmart® Buffer) a tampones con albúmina recombinante (NEBuffer r1.1, r2.1, r3.1 y rCutSmart™ Buffer). También estamos en proceso de adaptar todas las formulaciones de enzimas de restricción para que contengan rAlbúmina. Creemos que dejar de usar productos de origen animal es un paso en la dirección correcta y podemos ofrecer esta mejora al mismo precio. P: ¿Se puede almacenar el colorante de carga de gel, púrpura 6X (B7024) a bajas temperaturas? R: La temperatura de almacenamiento recomendada para el colorante de carga de gel, púrpura 6X, es temperatura ambiente (25 °C). Comúnmente, el SDS puede precipitarse de la solución cuando el tinte se almacena a bajas temperaturas. Este ligero precipitado puede disiparse dejando el vial a temperatura ambiente durante una hora o calentándolo suavemente durante 10 minutos. Mezcle el vial varias veces antes de usarlo para homogeneizar la solución.