Laboratorios biológicos de Nueva Inglaterra, R0682S, BsrFI-v2

BsrFI-v2 ha sido reformulado con albúmina recombinante (rAlbúmina) a partir del lote n.º 10254984. Categorías relacionadas Endonucleasas de restricción B Aplicaciones Digestión con enzimas de restricción Unidad de especificación Definición Una unidad se define como la cantidad de enzima necesaria para digerir 1 μg de ADN pBR322 en 1 hora a 37 °C en un volumen de reacción total de 50 μl. Condiciones de reacción Tampón rCutSmart™ 1X Incubar a 37 °C Tampón rCutSmart™ 1X Acetato de potasio 50 mM Tris-acetato 20 mM Acetato de magnesio 10 mM Albúmina recombinante 100 µg/ml (pH 7,9 a 25 °C) Actividad en tampones NE Tampón NE™ r1.1: 25 % Tampón NE™ r2.1: 25 % Tampón NE™ r3.1: 0 % Tampón rCutSmart™: 100 % Compatibilidad del diluyente Diluyente C Tampón de almacenamiento Tris-HCl 10 mM NaCl 250 mM DTT 1 mM EDTA 0,1 mM 200 µg/ml Albúmina recombinante 50 % Glicerol 0,15 % Triton® X-100 pH 7,4 a 25 °C Inactivación por calor Sin sensibilidad a la metilación Metilación en dam: No sensible Metilación en dcm: No sensible Metilación en CpG: Bloqueada Preguntas frecuentes P: ¿Qué es la actividad estrella y cómo se puede evitar? R: Se ha demostrado que, en condiciones extremas no estándar, las endonucleasas de restricción son capaces de escindir secuencias similares, pero no idénticas, a su secuencia de reconocimiento definida. Esta especificidad alterada o relajada se ha denominado actividad "estrella". Se ha sugerido que la actividad estrella puede ser una propiedad general de las endonucleasas de restricción y que cualquier endonucleasa de restricción puede escindir sitios no canónicos en ciertas condiciones extremas. La forma en que se altera la especificidad de una enzima depende de la enzima y de las condiciones empleadas para inducir la actividad estrella. Los tipos más comunes de actividad alterada son las sustituciones de bases individuales, el truncamiento de las bases externas en la secuencia de reconocimiento y el corte de hebras simples. La actividad estrella es completamente controlable en la gran mayoría de los casos y generalmente no es una preocupación cuando se realizan digestas de endonucleasas de restricción. Las enzimas de New England Biolabs no exhibirán actividad estrella cuando se usen bajo las condiciones recomendadas en sus NEBuffers suministrados. A continuación se enumeran las condiciones de reacción que se sabe que inducen o inhiben la actividad estrella. Condiciones que contribuyen a la actividad estrella 1. Alta concentración de glicerol [> 5% v/v] 2. Alta proporción de unidades a µg de ADN [varía con cada enzima, usualmente >100 unidades/µg] 3. Baja fuerza iónica [< 25 mM] 4. Alto pH [> pH 8.0] 5. Presencia de solventes orgánicos [DMSO, etanol, etilenglicol, dimetilacetamida, dimetilformamida, sulfalano] 6. Sustitución de Mg++ con otros cationes divalentes [Mn++, Cu++, Co++, Zn++] Inhibición de la actividad estrella Si le preocupa la actividad estrella, le recomendamos las siguientes pautas. 1. Use la menor cantidad de unidades posible para obtener una digestión completa. Esto evita la sobredigestión y reduce la concentración final de glicerol en la reacción. 2. Asegúrese de que la reacción esté libre de cualquier disolvente orgánico, como alcoholes, que puedan estar presentes en la preparación de ADN. 3. Aumente la fuerza iónica del tampón de reacción a 100-150 mM (siempre que la enzima no esté inhibida por un alto contenido de sal). 4. Disminuya el pH del tampón de reacción a pH 7,0. 5. Use Mg++ como catión divalente. P: ¿Cuántos nucleótidos tengo que agregar adyacentes al sitio de reconocimiento de RE para obtener un corte eficiente? R: Protocolo de digestión con enzimas de restricción: corte cerca del extremo del ADN P: ¿Esta enzima es sensible a la metilación de CpG de dam, dcm o mamíferos? R: Sí. Esta enzima no puede cortar los sitios de reconocimiento en el ADNg de mamíferos que están bloqueados por la metilación de CpG. Para obtener información actualizada sobre la sensibilidad a la metilación, visite Dam-Dcm y metilación de CpG o REBASE. P: ¿Es necesario que los sitios de reconocimiento degenerados sean palindrómicos? R: La mayoría de los sitios de reconocimiento de las enzimas de restricción son palindrómicos e incluyen solo pares de bases específicos (p. ej., EcoRI reconoce GAATTC). Sin embargo, algunas enzimas tienen sitios degenerados, lo que significa que contienen uno o más pares de bases no definidos específicamente (p. ej., BsrFI-v2 reconoce RCCGGY, donde R = A o G e Y = C o T). En el caso de las enzimas degeneradas, cualquier base representada por el código de una sola letra puede estar presente en cualquier ubicación del sitio de reconocimiento para que se produzca la escisión. Por ejemplo, BsrFI-v2 reconoce todas las siguientes secuencias: ACCGGC, ACCGGT, GCCGGC, GCCGGT. P: ¿Puede explicarme más sobre el cambio de BSA a albúmina recombinante (rAlbúmina) en NEBuffers? A: NEB se complace en anunciar que hemos cambiado los tampones de reacción con BSA (NEBuffer 1.1, 2.1, 3.1 y CutSmart® Buffer) por tampones con albúmina recombinante (NEBuffer r1.1, r2.1, r3.1 y rCutSmart™ Buffer). También estamos en proceso de adaptar todas las formulaciones de enzimas de restricción para que contengan albúmina recombinante. Creemos que dejar de usar productos con ingredientes de origen animal es un paso en la dirección correcta y podemos ofrecer esta mejora al mismo precio.