Laboratorios biológicos de Nueva Inglaterra, R0685S, AleI-v2

Esta enzima reemplaza a AleI ( Categorías relacionadas Endonucleasas de restricción: A Aplicaciones Preparación de ADN,, Digestión con enzimas de restricción,, Digestión con enzimas de restricción Especificación Definición de unidad Una unidad se define como la cantidad de enzima necesaria para digerir 1 µg de ADN λ en 1 hora a 37 °C en un volumen de reacción total de 50 μl. Condiciones de reacción Tampón rCutSmart™ 1X Incubar a 37 °C Tampón rCutSmart™ 1X Acetato de potasio 50 mM Tris-acetato 20 mM Acetato de magnesio 10 mM Albúmina recombinante 100 µg/ml (pH 7,9 a 25 °C) Actividad en tampones NE Tampón NE™ r1.1: <10 % Tampón NE™ r2.1: <10 % Tampón NE™ r3.1: <10% Tampón rCutSmart™: 100% Compatibilidad del diluyente Diluyente B Tampón de almacenamiento 10 mM Tris-HCl 200 mM NaCl 1 mM DTT 0,1 mM EDTA 200 µg/ml Albúmina recombinante 50% Glicerol pH 7,4 a 25 °C Inactivación por calor 65 °C durante 20 minutos Sensibilidad a la metilación metilación en presas: No sensible metilación en dcm: No sensible Metilación de CpG: Deteriorada por superposición Preguntas frecuentes P: ¿Cuál es la diferencia entre AleI (NEB n.º R0634) y AleI-v2 (NEB n.º R0685)? R: AleI-v2 reemplaza a AleI. Esta es una enzima más robusta que ha sido diseñada con una mutación para exhibir una estabilidad mejorada a -20 °C. AleI-v2 también puede inactivarse por calor a una temperatura más baja que AleI. P: ¿Cuándo es preocupante la actividad estrella? R: La actividad estrella es preocupante si las bandas adicionales pueden causar una interpretación errónea de los resultados en los procedimientos de genotipado y análisis mutacional. El diseño experimental puede promover la actividad estrella. Los volúmenes de reacción pequeños tienen mayor probabilidad de contener concentraciones de glicerol del 5 % o superiores, una condición que se sabe que aumenta la actividad estrella. Una concentración de glicerol del 5 % se produce al configurar una digestión doble en una reacción de 20 µl con 1 µl de cada enzima. Las digestaciones nocturnas tienen mayor probabilidad de generar actividad estrella. Para obtener consejos sobre cómo evitar la actividad estrella, haga clic aquí. P: Probé su enzima de restricción en el ADN sustrato recomendado por NEB y parece estar activa; sin embargo, no digiere mi ADN. ¿Cuál podría ser la razón? R: La calidad y la limpieza del ADN son factores importantes que pueden afectar la actividad enzimática. Las enzimas de restricción activas en el tampón rCutSmart®, pero no tan activas en el tampón NE r2.1 o r3.1 (nuestros tampones con mayor concentración de sal), pueden inhibirse. Por la sal en la reacción. Los procedimientos de purificación de ADN que utilizan columnas de centrifugación pueden dar como resultado soluciones de ADN con niveles significativos de sal que pueden transferirse a la reacción e inhibir la actividad enzimática. Para evitar esto, recomendamos que la solución de ADN añadida a la reacción no supere el 25 % del volumen total de reacción. Esto se puede lograr ajustando el volumen total de reacción según corresponda. P: ¿Qué enzimas de restricción NEB se suministran con el colorante de carga de gel morado (6X)? R: Todas las enzimas de restricción HF y la mayoría de las enzimas de restricción NEB no HF se suministran con el colorante de carga de gel morado (6X). Las enzimas de restricción no HF que se suministran con el colorante morado son: AatII AsiSI BsmBI-v2 EagI MboI NlaIII PvuI SmaI Acil AvrII BspHI EcoRI MboII NotI RsaI SpeI AfeI BamHI BsrGI EcoRV MluI NspI SacI StuI AflII BbsI ClaI Esp3I FseI MseI PacI SacII AgeI BglII DdeI HaeIII MspI PciI SalI XbaI AluI BsaI DpnI HindIII NcoI PmeI SapI XhoI ApaI BseYI DpnII HpaI NdeI PsiI-v2 SfaNI XmaI ApeKI BsiWI DraI KpnI NheI PstI SfiI XmnI AscI * Todas las enzimas de restricción HF también se suministran con colorante de carga de gel, púrpura (6X) P: ¿Los sitios de reconocimiento degenerados deben ser palindrómicos? R: La mayoría de los sitios de reconocimiento de enzimas de restricción son palindrómicos e incluyen solo pares de bases específicos (es decir, EcoRI reconoce GAATTC). Sin embargo, algunas enzimas tienen sitios degenerados, lo que significa que contienen uno o más pares de bases que no están específicamente definidos (es decir, BsrFI-v2 reconoce RCCGGY, donde R = A o G e Y = C o T). Para las enzimas degeneradas, cualquier base representada por el código de una sola letra puede estar presente en Ubicación en el sitio de reconocimiento para que se produzca la escisión. Por ejemplo, BsrFI-v2 reconoce todas las siguientes secuencias: ACCGGC, ACCGGT, GCCGGC, GCCGGT. P: ¿Es esta enzima sensible a la metilación de CpG de dam, dcm o mamíferos? R: Sí. Esta enzima no puede cortar los sitios de reconocimiento en el ADNg de mamíferos que se ven afectados por la metilación superpuesta de CpG. Para obtener información actualizada sobre las sensibilidades a la metilación, visite Dam-Dcm y metilación de CpG o REBASE. P: ¿Puede contarme más sobre el cambio de BSA a albúmina recombinante (rAlbúmina) en los tampones NEBuffer? R: NEB se complace en anunciar que hemos cambiado los tampones de reacción que contienen BSA (NEBuffer 1.1, 2.1, 3.1 y CutSmart® Buffer) a tampones que contienen albúmina recombinante (NEBuffer r1.1, r2.1, r3.1 y Tampón rCutSmart™). También estamos en proceso de adaptar todas las formulaciones de enzimas de restricción para que contengan rAlbúmina. Consideramos que dejar de usar productos con ingredientes de origen animal es un paso en la dirección correcta y podemos ofrecer esta mejora al mismo precio. P: ¿Es compatible el colorante de carga de gel, púrpura (6X) o el colorante de carga de gel, púrpura (6X), sin SDS, con otros colorantes de unión al ADN como SYBR® y GelRed™ durante la electroforesis en gel? R: Dado que los colorantes de unión a ácidos nucleicos de alta afinidad pueden afectar la migración del ADN durante la electroforesis, se recomienda encarecidamente la tinción posterior de los geles con colorantes SYBR o GelRed. Sin embargo, estos colorantes también se pueden usar como colorantes prefabricados (en el gel de agarosa). Dado que el colorante de carga de gel, púrpura (6X), tiene una mayor concentración en SDS, se pueden observar algunas interferencias al usar SYBR o GelRed como colorantes prefabricados. Al usar estos colorantes como colorantes prefabricados, NEB recomienda usar nuestro colorante de carga de gel. Púrpura, sin SDS (6X) (NEB n.° B7025S). Siga las recomendaciones a continuación para ambos colorantes púrpura al usar colorantes SYBR como colorantes prefabricados: Reduzca la cantidad de ADN de muestra cargado a 250 a 500 ng y use solo 0,5X de colorantes SYBR en geles prefabricados. Estos colorantes son mucho más sensibles que el EtBr. Las bandas quemadas o manchadas pueden deberse a una sobrecarga. Si usa el colorante de carga de gel, púrpura (6X) B7024S, use TBE en lugar del tampón TAE, ya que la interferencia de SDS aumenta al usar el tampón TAE (en el gel y como tampón de ejecución). Use los colorantes SYBR según las recomendaciones del fabricante: agregue primero el colorante SYBR al tampón TBE y luego agregue la mezcla de colorante SYBR/TBE a la solución de agarosa fundida. Es preferible esperar unos minutos para agregar los colorantes SYBR a la agarosa fundida. Agregarlo a un enfriado La solución de agarosa (superior a la temperatura de gelificación, 45 °C) produce mejores resultados. Analice siempre un gel de agarosa recién preparado, para una sola ejecución. Repetir el análisis del gel dará resultados deficientes. Siga las siguientes recomendaciones para ambos colorantes púrpura al utilizar colorantes GelRed como colorantes prefabricados: Reduzca la cantidad de ADN de muestra cargado a 60-125 ng y utilice solo 0,5 veces el colorante GelRed en los geles prefabricados. Este colorante es mucho más sensible que el EtBr. Las bandas quemadas o manchadas pueden deberse a una sobrecarga. Es preferible esperar unos minutos para añadir el colorante GelRed a la agarosa fundida. Añadirlo a una solución de agarosa fría (superior a la temperatura de gelificación, 45 °C) produce mejores resultados. Analice siempre un gel de agarosa recién preparado, para una sola ejecución. Repetir el análisis del gel dará resultados deficientes. SYBR® es una marca registrada de Life Technologies Corporation. GelRed™ es una marca registrada de Biotium.