Laboratorios biológicos de Nueva Inglaterra, R0701S, BfuAI

El tamaño grande de este producto se discontinuó el 15 de diciembre de 2025. El tamaño pequeño seguirá estando disponible. Categorías relacionadas Endonucleasas de restricción B,, Enzimas de restricción calificadas que ahorran tiempo Aplicaciones Clonación rápida: acelere sus flujos de trabajo de clonación con reactivos de NEB,, Definición de la unidad de especificación de digestión con enzimas de restricción Una unidad se define como la cantidad de enzima necesaria para digerir 1 µg de ADN λ en 1 hora a 50 °C en un volumen de reacción total de 50 μl. Condiciones de reacción 1X NEBuffer™ r3.1 Incubar a 50 °C 1X NEBuffer™ r3.1 100 mM NaCl 50 mM Tris-HCl 10 mM MgCl2 100 µg/ml Albúmina recombinante (pH 7,9 a 25 °C) Actividad en NEBuffers NEBuffer™ r1.1: <10 % NEBuffer™ r2.1: 25 % NEBuffer™ r3.1: 100 % Tampón rCutSmart™: 10 % Compatibilidad del diluyente Diluyente B Tampón de almacenamiento 10 mM Tris-HCl 300 mM NaCl 1 mM DTT 0,1 mM EDTA 500 µg/ml Albúmina recombinante 50 % Glicerol pH 7,4 a Inactivación por calor a 25 °C a 65 °C durante 20 minutos Sensibilidad a la metilación Metilación en diques: no sensible Metilación en dcm: no sensible Metilación en CpG: alterada por actividad superpuesta a temperatura de 37 °C: 25 % Preguntas frecuentes P: ¿Qué es la actividad estrella y cómo se puede evitar? R: Se ha demostrado que, en condiciones extremas no estándar, las endonucleasas de restricción son capaces de escindir secuencias similares, pero no idénticas, a su secuencia de reconocimiento definida. Esta especificidad alterada o relajada se ha denominado actividad "estrella". Se ha sugerido que la actividad estrella puede ser una propiedad general de las endonucleasas de restricción y que cualquier endonucleasa de restricción puede escindir sitios no canónicos en ciertas condiciones extremas. La manera en que se altera la especificidad de una enzima depende de la enzima y de las condiciones empleadas para inducir la actividad estrella. Los tipos más comunes de actividad alterada son las sustituciones de bases individuales, el truncamiento de las bases externas en la secuencia de reconocimiento y el corte de cadenas simples. La actividad estrella es completamente controlable en la gran mayoría de los casos y generalmente no representa un problema al realizar digestores con endonucleasas de restricción. Las enzimas de New England Biolabs no presentan actividad estrella cuando se utilizan en las condiciones recomendadas en los NEBuffers suministrados. A continuación, se enumeran las condiciones de reacción que se sabe que inducen o inhiben la actividad estrella. Condiciones que contribuyen a la actividad estelar 1. Alta concentración de glicerol [> 5% v/v] 2. Alta proporción de unidades a µg de ADN [varía con cada enzima, normalmente >100 unidades/µg] 3. Baja fuerza iónica [< 25 mM] 4. pH alto [> pH 8,0] 5. Presencia de disolventes orgánicos [DMSO, etanol, etilenglicol, dimetilacetamida, dimetilformamida, sulfalano] 6. Sustitución de Mg++ por otros cationes divalentes [Mn++, Cu++, Co++, Zn++] Inhibición de la actividad estelar Si le preocupa la actividad estelar, le recomendamos las siguientes directrices. 1. Utilice la menor cantidad de unidades posible para obtener una digestión completa. Esto evita la sobredigestión y reduce la concentración final de glicerol en la reacción. 2. Asegúrese de que la reacción esté libre de disolventes orgánicos, como alcoholes, que podrían estar presentes en la preparación de ADN. 3. Aumente la fuerza iónica del tampón de reacción a 100-150 mM (siempre que la enzima no se vea inhibida por un alto contenido de sal). 4. Disminuya el pH del tampón de reacción a pH 7,0. 5. Utilice Mg++ como catión divalente. P: ¿Tengo que configurar las digestiones con enzimas cualificadas Time-Saver™ durante 5-15 minutos? ¿Puedo digerir durante más tiempo? R: Las enzimas Time-Saver™ de NEB tienen la ventaja de trabajar rápido (5-15 minutos), pero también están diseñadas y cualificadas para soportar digestiones durante la noche sin degradación del ADN. P: ¿Esta enzima es sensible a la metilación de CpG de dam, dcm o mamíferos? R: Sí. Esta enzima no puede cortar los sitios de reconocimiento en el ADNg de mamíferos que se ven afectados por la metilación superpuesta de CpG. Para obtener información actualizada sobre las sensibilidades de metilación, visite Dam-Dcm y metilación de CpG o REBASE. P: ¿Podrían contarme más sobre la transición de BSA a albúmina recombinante (rAlbúmina) en los tampones NEB? R: En NEB nos complace anunciar que hemos cambiado los tampones de reacción con BSA (NEBuffer 1.1, 2.1, 3.1 y CutSmart®) por tampones con albúmina recombinante (NEBuffer r1.1, r2.1, r3.1 y rCutSmart™). También estamos en proceso de adaptar todas las formulaciones de enzimas de restricción para que contengan rAlbúmina. Creemos que dejar de usar productos de origen animal es un paso en la dirección correcta y podemos ofrecer esta mejora al mismo precio.