Laboratorios biológicos de Nueva Inglaterra, R0703L, BtgZI

Aprenda sobre la fidelidad de la ligasa y supere los límites de las categorías relacionadas Endonucleasas de restricción B Aplicaciones Soluciones de automatización y clonación de alto rendimiento, Digestión con enzimas de restricción Unidad de especificación Definición Una unidad se define como la cantidad de enzima necesaria para digerir 1 µg de ADN λ en 1 hora a 60 °C en un volumen de reacción total de 50 μl. Condiciones de reacción Tampón rCutSmart™ 1X Incubar a 60 °C Tampón rCutSmart™ 1X Acetato de potasio 50 mM Tris-acetato 20 mM Acetato de magnesio 10 mM Albúmina recombinante 100 µg/ml (pH 7,9 a 25 °C) Actividad en tampones NE Tampón NE™ r1.1: 10 % Tampón NE™ r2.1: 25 % Tampón NE™ r3.1: <10 % Tampón rCutSmart™: 100 % Compatibilidad del diluyente Diluyente A Tampón de almacenamiento Tris-HCl 10 mM KCl 50 mM DTT 1 mM EDTA 0,1 mM 200 µg/ml BSA Glicerol al 50 % pH 7,4 a Inactivación por calor a 25 °C 80 °C durante 20 minutos Sensibilidad a la metilación Metilación en dam: no sensible Metilación en dcm: no sensible Metilación de CpG: actividad alterada a temperatura a 37 °C: 50 % Preguntas frecuentes P: ¿Cuál es la actividad de BtgZI a 37 °C? R: BtgZI tiene una actividad del 75 % a 37 °C. P: ¿La metilación bloquea la actividad de BtgZi? R: La metilación de CpG bloquea la escisión del ADN genómico de mamíferos. Para obtener información actualizada sobre las sensibilidades a la metilación, visite Dam-Dcm y metilación de CpG o REBASE. P: ¿Por qué las bandas de ADN que se procesan en un gel de agarosa están manchadas? R: BtgZI puede permanecer unido al ADN después del corte y alterar la velocidad de migración del ADN durante la electroforesis. Para interrumpir la unión, añada SDS a una concentración final del 0,5 % o purifique el ADN antes de la electroforesis. P: Probé su enzima de restricción en el ADN sustrato recomendado por NEB y parece estar activa; sin embargo, no digiere mi ADN. ¿Cuál podría ser la razón? R: La calidad y la limpieza del ADN son factores importantes que pueden afectar la actividad enzimática. Las enzimas de restricción activas en el tampón rCutSmart®, pero no tan activas en el tampón NE r2.1 o r3.1 (nuestros tampones con mayor concentración de sal), pueden verse inhibidas por la sal presente en la reacción. Los procedimientos de purificación de ADN que utilizan columnas de centrifugación pueden generar soluciones de ADN con niveles significativos de sal que pueden transferirse a la reacción e inhibir la actividad enzimática. Para evitar esto, recomendamos que la solución de ADN añadida a la reacción no supere el 25 % del volumen total de la reacción. Esto se puede lograr ajustando el volumen total de la reacción según corresponda. P: ¿Qué enzimas de restricción se utilizan en GoldenBraid Assembly? R: BsaI es una enzima de tipo IIS utilizada en este método. NEB también ofrece una versión de alta fidelidad diseñada de esta enzima, BsaI-HF®v2, que tiene el beneficio adicional de estar calificada para Time-Saver™ (puede digerir ADN en 5-15 minutos y puede digerirse de forma segura durante la noche) y exhibe una actividad estrella reducida. BsaI-HFv2 funciona en el tampón CutSmart®, al igual que la ADN ligasa T4 (también parte del flujo de trabajo GoldenBraid), que es 100% funcionalmente activa en este tampón, cuando la reacción se complementa con 1 mM de ATP. Otras enzimas de tipo IIS utilizadas en GoldenBraid incluyen BsmBI-v2/Esp3I, BtgZI, BbsI/BbsI-HF y PaqCI (isoesquizómero AarI con secuencia de reconocimiento de 7 pb). Referencia: GoldenBraid 2.0: Un marco integral de ensamblaje de ADN para la biología sintética de plantas P: ¿Qué enzimas de restricción se utilizan en el ensamblaje Golden Gate? R: El ensamblaje Golden Gate es un método de clonación eficiente en un solo tubo basado en enzimas de restricción de tipo IIS que escinden fuera de sus sitios de reconocimiento y dejan salientes de 3 o 4 bases. BsaI es la enzima de tipo IIS más utilizada para el ensamblaje Golden Gate. NEB también ofrece una versión de alta fidelidad de esta enzima, BsaI-HF®v2, que cuenta con la ventaja adicional de estar certificada como Time-Saver™ (puede digerir el ADN en 5-15 minutos o durante la noche sin degradarlo) y presenta una actividad estrella drásticamente reducida. Otras enzimas de tipo IIS utilizadas en el ensamblaje Golden Gate incluyen BsmBI-v2/Esp3I, BbsI/BbsI-HF, PaqCI (isoesquizómero AarI con secuencia de reconocimiento de 7 pb) y SapI/BspQI/BspQI-HF (con secuencia de reconocimiento de 7 pb y salientes de 3 pb). P: ¿Podrían contarme más sobre la transición de BSA a albúmina recombinante (rAlbúmina) en los tampones NEB? R: En NEB nos complace anunciar que hemos cambiado los tampones de reacción con BSA (NEBuffer 1.1, 2.1, 3.1 y CutSmart®) por tampones con albúmina recombinante (NEBuffer r1.1, r2.1, r3.1 y rCutSmart™). También estamos en proceso de adaptar todas las formulaciones de enzimas de restricción para que contengan rAlbúmina. Creemos que dejar de usar productos de origen animal es un paso en la dirección correcta y podemos ofrecer esta mejora al mismo precio.