Laboratorios biológicos de Nueva Inglaterra, R0711S, NmeAIII

SAM ahora incluido en la formulación enzimática; ya no se suministra en viales separados. Categorías relacionadas : Endonucleasas de restricción: NO Aplicaciones: Digestión con enzimas de restricción. Unidad de especificación: Definición. Una unidad se define como la cantidad de enzima necesaria para digerir 1 µg de ADN ΦX174 RF I en 1 hora a 37 °C en un volumen total de reacción de 50 μl. Condiciones de reacción Tampón rCutSmart™ 1X Incubar a 37 °C Tampón rCutSmart™ 1X Acetato de potasio 50 mM Tris-acetato 20 mM Acetato de magnesio 10 mM Albúmina recombinante 100 µg/ml (pH 7,9 a 25 °C) Actividad en tampones NE Tampón NE™ r1.1: 10 % Tampón NE™ r2.1: 10 % Tampón NE™ r3.1: <10 % Tampón rCutSmart™: 100 % Compatibilidad del diluyente Diluyente B Tampón de almacenamiento Tris-HCl 10 mM NaCl 300 mM DTT 1 mM EDTA 0,1 mM S-adenosilmetionina (SAM) 0,32 mM 500 µg/ml BSA 50% Glicerol pH 7.4 a 25°C Inactivación por calor 65°C durante 20 minutos Sensibilidad a la metilación dam metilación : No sensible metilación dcm: No sensible Metilación CpG: No sensible Preguntas frecuentes P: ¿Cómo puedo buscar una enzima de restricción por secuencia, saliente o nombre? R: El buscador de enzimas, una nueva herramienta disponible en nuestro sitio web en la barra lateral bajo "Herramientas favoritas", se puede usar para buscar enzimas de restricción por nombre, secuencia, saliente o tipo. Las enzimas NEB incluyen íconos de propiedades enzimáticas y se muestran como enlaces. P: ¿Cómo debo detener mi digestión de restricción? R: Si no se planean más manipulaciones del ADN digerido, la reacción se puede terminar agregando una solución de parada. En NEB, utilizamos la siguiente solución de parada: 50% glicerol, 50 mM EDTA (pH 8,0) y 0,05% azul de bromofenol (10 μl / 50 μl de reacción). Si se requieren más manipulaciones del ADN digerido, la inactivación por calor (aumentar la temperatura a 65 u 80 °C durante 20 minutos) es el método más sencillo para detener una reacción. Dado que este método no funciona con todas las enzimas de restricción, consulte la información del catálogo de la(s) enzima(s) específica(s) que esté utilizando. La extracción con fenol/cloroformo es otro medio para inactivar una enzima de restricción. P: ¿Qué tan estable es una enzima de restricción específica? R: Todas las enzimas se analizan para determinar su actividad cada 3-6 meses; la fecha del ensayo más reciente se encuentra en la etiqueta adherida a cada vial de enzima. Tras treinta años de experiencia con enzimas de restricción, hemos comprobado que la mayoría son muy estables cuando se almacenan a -20 °C en el tampón de almacenamiento recomendado. La exposición a temperaturas superiores a -20 °C debe minimizarse siempre que sea posible. P: ¿Cuándo debo elegir la versión HF de una enzima? R: La versión HF de la enzima tiene la misma especificidad de escisión que la enzima de tipo silvestre y debe elegirse si la actividad estrella es preocupante o si el tampón recomendado es más conveniente para la digestión doble u otro protocolo de varios pasos. No hay ninguna desventaja en usar la versión HF. P: ¿Cuándo es preocupante la actividad estrella? R: La actividad estrella es preocupante si las bandas adicionales pueden causar una interpretación errónea de los resultados en los procedimientos de genotipado y análisis mutacional. El diseño experimental puede promover la actividad estrella. Es más probable que los volúmenes de reacción pequeños contengan concentraciones de glicerol del 5 % o superiores, una condición que se sabe que aumenta la actividad estrella. Se produce una concentración de glicerol del 5 % al configurar una digestión doble en una reacción de 20 µl utilizando 1 µl de cada enzima. Las digestiones nocturnas son más propensas a generar actividad estrella. Para obtener consejos sobre cómo evitar la actividad estrella, haga clic aquí. P: ¿Qué significa la certificación Time-Saver™? R: Las enzimas con certificación Time-Saver digieren el sustrato de ensayo unitario en 5-15 minutos bajo las condiciones de reacción recomendadas y también pueden usarse de forma segura en digestores nocturnos. P: ¿Cómo debo configurar una digestión de restricción? R: La mayoría de los investigadores siguen la regla general de que 10 unidades de endonucleasa de restricción son suficientes para compensar la variabilidad en la fuente, cantidad y pureza del ADN. Generalmente, se añade 1 μl de enzima a 1 μg de ADN purificado en un volumen final de 50 μl del tampón NE 1X adecuado, seguido de una incubación de 1 hora a la temperatura recomendada. Si se utiliza un exceso de enzima, la duración de la incubación suele reducirse para ahorrar tiempo. Alternativamente, se puede digerir productivamente con menos unidades de enzima durante hasta 16 horas con muchas enzimas de restricción. Para mantener la concentración de glicerol por debajo del 5% en una reacción, la enzima de restricción, que se suministra en glicerol al 50%, no debe superar el 10% del volumen total de la reacción. Un elemento extremadamente importante, aunque a menudo pasado por alto, para una digestión de restricción exitosa es la mezcla. La reacción debe estar completamente mezclada para lograr una digestión completa. Recomendamos pipetear suavemente la mezcla de reacción hacia arriba y hacia abajo o agitar el tubo de reacción. A continuación, realice una centrifugación rápida ("a toque") en una microcentrífuga. No agite la reacción en vórtex. P: No observo ninguna división después de mi digestión de restricción. ¿Qué factores pueden interferir con la división? R: La preparación del ADN a dividir debe estar libre de contaminantes como fenol, cloroformo, alcohol, EDTA, detergentes o exceso de sales, ya que todos ellos pueden interferir con la actividad de la enzima de restricción. La metilación del ADN también es un elemento importante de una digestión de restricción. Si tiene dificultades para dividir su sustrato de ADN, le recomendamos las siguientes reacciones de control. Incubar el ADN experimental sin enzima de restricción (la degradación del ADN indica contaminación en la preparación de ADN o el tampón de reacción) y el ADN de control (ADN con múltiples sitios conocidos para la enzima, p. ej., ADN de lambda o adenovirus-2) con enzima de restricción para determinar con mayor precisión si la reacción se completó. Si el ADN de control se escinde y el ADN experimental resiste la escisión, se pueden mezclar ambos ADN para determinar si hay un inhibidor presente en la muestra experimental. Si hay un inhibidor (generalmente sal, EDTA o fenol), el ADN de control no se cortará después de mezclarlo. P: ¿Cómo puedo generar un mapa de sitios de enzimas de restricción para mi secuencia? R: NEBcutter®, un programa informático para el mapeo de sitios de enzimas de restricción, está disponible en el sitio web de NEB, en la barra lateral, en "Herramientas favoritas". El programa acepta secuencias recuperadas de un archivo local o GenBank. También acepta una secuencia de entrada pegada en un campo designado. Al presentar una secuencia, NEBcutter encontrará los marcos de lectura abiertos más amplios dentro de ella e indicará las enzimas de restricción que podrían usarse para escindir el gen. También localiza las posiciones de todas las enzimas de restricción que solo cortan una vez dentro de la secuencia seleccionada. NEBcutter también conoce a fondo la información sobre la sensibilidad a la metilación de las enzimas de restricción y alerta al usuario sobre la metilación superpuesta por dam, dcm, etc. P: ¿Qué información hay disponible en la Base de Datos de Enzimas de Restricción (REBASE)? R: La Base de Datos de Enzimas de Restricción (REBASE), disponible en la barra lateral de "Herramientas Favoritas" de nuestro sitio web, es una base de datos completa con información sobre enzimas de restricción y proteínas relacionadas. Contiene referencias publicadas e inéditas, sitios de reconocimiento y escisión, isoesquizómeros, disponibilidad comercial, sensibilidad a la metilación, datos de cristales y secuencias. También incluye ADN metiltransferasas, endonucleasas homing, enzimas de corte, subunidades de especificidad y proteínas de control. Recientemente, se han añadido posibles metiltransferasas de ADN y enzimas de restricción, como se predijo a partir del análisis de secuencias genómicas. P: ¿Se recomienda una digestión prolongada (tiempos de incubación > 1 hora)? R: La definición de unidad de nuestras enzimas de restricción se basa en una incubación de 1 hora. El tiempo de incubación puede acortarse si se añaden unidades adicionales de enzima de restricción a la reacción. Por el contrario, a menudo se utilizan tiempos de incubación más largos para permitir que una reacción se complete con menos unidades de enzima. Esto depende de cuánto tiempo una enzima en particular puede sobrevivir (mantener su actividad) en una reacción. Algunas enzimas sobreviven durante largos períodos (> 16 horas), mientras que otras sobreviven solo una hora o menos en una reacción. Para cada enzima de restricción, informamos el número mínimo de unidades (1,0, 0,5, 0,25 o 0,13) necesarias para digerir 1 µg de ADN sustrato en 16 horas. Las enzimas que requieren menos de 1 unidad pueden utilizarse en concentraciones más bajas para tiempos de incubación prolongados. Tenga en cuenta que los sustratos de ADN se digieren a velocidades variables, el número real de unidades requeridas para una digestión completa cambiará de sustrato a sustrato. Verifique la información individual de la enzima de restricción antes de extender los tiempos de reacción, ya que las que muestran actividad estrella deben usarse bajo las condiciones recomendadas para inhibir la escisión no canónica. P: ¿Los sitios de reconocimiento degenerados necesitan ser palindrómicos? R: La mayoría de los sitios de reconocimiento de enzimas de restricción son palindrómicos e incluyen solo pares de bases específicos (es decir, EcoRI reconoce GAATTC). Sin embargo, algunas enzimas tienen sitios degenerados, lo que significa que contienen uno o más pares de bases que no están específicamente definidos (es decir, BsrFI-v2 reconoce RCCGGY, donde R = A o G e Y = C o T). Para las enzimas degeneradas, cualquier base representada por el código de una sola letra puede estar presente en cualquier ubicación en el sitio de reconocimiento para que ocurra la escisión. Por ejemplo, BsrFI-v2 reconoce todas las siguientes secuencias: ACCGGC, ACCGGT, GCCGGC, GCCGGT. P: Probé su enzima de restricción en el sustrato de ADN recomendado por NEB y parece estar activa; sin embargo, no digiere mi ADN. ¿Cuál podría ser la razón? R: La calidad y la limpieza del ADN son factores importantes que pueden afectar la actividad enzimática. Las enzimas de restricción activas en el tampón rCutSmart®, pero no tan activas en el tampón NE r2.1 o r3.1 (nuestros tampones con mayor concentración de sal), pueden verse inhibidas por la sal presente en la reacción. Los procedimientos de purificación de ADN que utilizan columnas de centrifugación pueden generar soluciones de ADN con niveles significativos de sal que pueden transferirse a la reacción e inhibir la actividad enzimática. Para evitar esto, recomendamos que la solución de ADN añadida a la reacción no supere el 25 % del volumen total de la reacción. Esto se puede lograr ajustando el volumen total de la reacción según corresponda. P: ¿Es esta enzima sensible a la metilación de dam, dcm o CpG de mamíferos? R: No. Esta enzima no es sensible a la metilación de dam, dcm ni CpG de mamíferos. Para obtener información actualizada sobre la sensibilidad a la metilación, visite Dam-Dcm y metilación de CpG o REBASE. P: ¿NmeAIII requiere SAM para su actividad? R: Sí, la S-adenosilmetionina (SAM) es necesaria para una actividad óptima (SAM se incluye en la formulación enzimática desde octubre de 2020). Si no está seguro de si SAM está presente en la formulación enzimática y tiene un vial de SAM de NEB, puede añadir SAM a la reacción según las directrices anteriores. P: ¿Podría darme más información sobre el cambio de BSA a albúmina recombinante (rAlbúmina) en los tampones NE? A: NEB se complace en anunciar que hemos cambiado los tampones de reacción con BSA (NEBuffer 1.1, 2.1, 3.1 y CutSmart® Buffer) por tampones con albúmina recombinante (NEBuffer r1.1, r2.1, r3.1 y rCutSmart™ Buffer). También estamos en proceso de adaptar todas las formulaciones de enzimas de restricción para que contengan albúmina recombinante. Creemos que dejar de usar productos con ingredientes de origen animal es un paso en la dirección correcta y podemos ofrecer esta mejora al mismo precio.