Laboratorios biológicos de Nueva Inglaterra, R0725S, WarmStart® Nt.BstNBI

Categorías relacionadas Endonucleasas de mellado, Endonucleasas de restricción: NO, Endonucleasas de restricción Aplicaciones Amplificación por desplazamiento de cadena y mellado Especificación de enzimas Definición de unidad Una unidad se define como la cantidad de enzima necesaria para digerir 1 µg de ADN T7 en NEBuffer r3.1 en 1 hora a 55 °C en un volumen de reacción total de 50 μl. Condiciones de reacción 1X NEBuffer™ r3.1 Incubar a 55 °C 1X NEBuffer™ r3.1 100 mM NaCl 50 mM Tris-HCl 10 mM MgCl2 100 µg/ml Albúmina recombinante (pH 7,9 a 25 °C) Concentración de uso 10X Actividad en NEBuffers NEBuffer™ r1.1: 0 % NEBuffer™ r2.1: 10 % NEBuffer™ r3.1: 100 % Tampón rCutSmart™: 25 % Compatibilidad del diluyente Diluyente A Tampón de almacenamiento 10 mM Tris-HCl 50 mM KCl 1 mM DTT 0,1 mM EDTA 200 µg/ml Albúmina recombinante 50 % Glicerol pH 7,4 a 25 °C Inactivación por calor 80 °C durante 20 minutos Sensibilidad a la metilación dam metilación: No sensible dcm metilación: No sensible CpG metilación: No sensible Actividad a temperatura a 37 °C: 0 % Preguntas frecuentes P: ¿Qué ventajas ofrece WarmStart® Nt.BstNBI? R: WarmStart® Nt.BstNBI se puede utilizar en aplicaciones en las que se utiliza Nt.BstNBI. El aptámero en WarmStart Nt.BstNBI inhibe la actividad de mellado por debajo de 40 °C, por lo tanto, la enzima solo se activa completamente cuando se alcanzan temperaturas de reacción de 50-60 °C. Esta característica permite el ensamblaje de ensayos de alto rendimiento y la configuración a temperatura ambiente (como SDA). Además, como la actividad enzimática se controla con precisión, los resultados son consistentes y las variaciones entre réplicas son bajas. P: ¿Qué es la amplificación por desplazamiento de cadena (SDA)? R: La amplificación por desplazamiento de cadena es un método isotérmico de amplificación de ADN in vitro que utiliza una enzima de corte para cortar una cadena de ADN bicatenario y una ADN polimerasa con deficiencia de exonucleasa para extender el extremo 3' en el corte y desplazar la cadena de ADN aguas abajo (GT Walker, 1992). Este método permite detectar rápidamente un ácido nucleico diana con alta sensibilidad en el punto de atención y se ha convertido en un método popular de diagnóstico molecular. Mostramos una reacción típica de SDA con WarmStart Nt.BstNBI (NEB #R0725) y la ADN polimerasa Bst 2.0 WarmStart® (NEB #M0538) para detectar la diana hBRCA1 en ADN genómico HeLa en WarmStart Nt.BstNBI. Para obtener más información y ver nuestra oferta de productos de amplificación por desplazamiento de cadena y amplificación por enzima de corte, visite aquí. P: ¿Cuándo es preocupante la actividad estelar? R: La actividad estrella es preocupante si las bandas adicionales pueden causar una interpretación errónea de los resultados en los procedimientos de genotipado y análisis mutacional. El diseño experimental puede promover la actividad estrella. Es más probable que los volúmenes de reacción pequeños contengan concentraciones de glicerol del 5 % o superiores, una condición que se sabe que aumenta la actividad estrella. Una concentración de glicerol del 5 % se produce al configurar una digestión doble en una reacción de 20 µl con 1 µl de cada enzima. Las digestaciones nocturnas son más propensas a generar actividad estrella. Para obtener consejos sobre cómo evitar la actividad estrella, haga clic aquí. P: ¿Qué enzimas de restricción NEB se suministran con el colorante de carga de gel morado (6X)? R: Todas las enzimas de restricción HF y la mayoría de las enzimas de restricción NEB no HF se suministran con el colorante de carga de gel morado (6X). Las enzimas de restricción no HF que vienen suministradas con el tinte púrpura son: AatII AsiSI BsmBI-v2 EagI MboI NlaIII PvuI SmaI Acil AvrII BspHI EcoRI MboII NotI RsaI SpeI AfeI BamHI BsrGI EcoRV MluI NspI SacI StuI AflII BbsI ClaI Esp3I FseI MseI PacI SacII AgeI BglII DdeI HaeIII MspI PciI SalI XbaI AluI BsaI DpnI HindIII NcoI PmeI SapI XhoI ApaI BseYI DpnII HpaI NdeI PsiI-v2 SfaNI XmaI ApeKI BsiWI DraI KpnI NheI PstI SfiI XmnI AscI * Todas las enzimas de restricción HF también se suministran con tinte de carga en gel, morado (6X) P: ¿Se está cargando gel? ¿Es compatible el colorante púrpura (6X) o el colorante de carga de gel púrpura (6X) sin SDS con otros colorantes de unión al ADN, como SYBR® y GelRed™, durante la electroforesis en gel? R: Dado que los colorantes de alta afinidad para la unión de ácidos nucleicos pueden afectar la migración del ADN durante la electroforesis, se recomienda encarecidamente la tinción posterior de los geles con colorantes SYBR o GelRed. Sin embargo, estos colorantes también pueden utilizarse como colorantes prefabricados (en el gel de agarosa). Dado que el colorante de carga de gel púrpura (6X) tiene una mayor concentración en SDS, se pueden observar interferencias al utilizar SYBR o GelRed como colorantes prefabricados. Al utilizar estos colorantes como colorantes prefabricados, NEB recomienda utilizar nuestro colorante de carga de gel púrpura, sin SDS (6X) (NEB n.° B7025S). Por favor, siga las recomendaciones a continuación para ambos colorantes púrpura cuando use colorantes SYBR como colorantes prefabricados: Reduzca la cantidad de ADN de muestra cargado a 250 a 500 ng, y use solo 0,5X de colorantes SYBR en geles prefabricados. Estos colorantes son mucho más sensibles que el EtBr. Las bandas reventadas o manchadas pueden deberse a una sobrecarga. Si usa el colorante de carga de gel, púrpura (6X) B7024S, use TBE en lugar del tampón TAE, ya que la interferencia de SDS aumenta cuando se usa el tampón TAE (en el gel y como tampón de ejecución). Use los colorantes SYBR como lo recomienda el fabricante: agregue primero el colorante SYBR al tampón TBE, luego agregue la mezcla de colorante SYBR/TBE a la solución de agarosa fundida. Es preferible esperar unos minutos para agregar los colorantes SYBR a la agarosa fundida. Agregarlo a una solución de agarosa enfriada (por encima de la temperatura de gelificación, 45 °C) produce mejores resultados. Utilice siempre un gel de agarosa recién preparado para una sola ejecución. Repetir el análisis del gel dará resultados deficientes. Siga las recomendaciones a continuación para ambos colorantes púrpura al utilizar colorantes GelRed como colorantes prefabricados: Reduzca la cantidad de ADN de muestra cargado a 60-125 ng y utilice solo 0,5 veces el colorante GelRed en los geles prefabricados. Este colorante es mucho más sensible que el EtBr. Las bandas quemadas o manchadas pueden deberse a una sobrecarga. Es preferible esperar unos minutos para añadir el colorante GelRed a la agarosa fundida. Añadirlo a una solución de agarosa fría (por encima de la temperatura de gelificación, 45 °C) produce mejores resultados. Utilice siempre un gel de agarosa recién preparado para una sola ejecución. Repetir el análisis del gel dará resultados deficientes. SYBR® es una marca registrada de Life Technologies Corporation. GelRed™ es una marca registrada de Biotium.