Laboratorios biológicos de Nueva Inglaterra, R0739L, BsmBI-v2

BsmBI-v2 ha sido reformulado con albúmina recombinante (rAlbúmina) a partir del lote n.º 10284618. Categorías relacionadas Endonucleasas de restricción B,, Enzimas de restricción calificadas que ahorran tiempo Aplicaciones Soluciones de automatización y clonación de alto rendimiento,, Preparación de ADN,, Análisis de ADN, Definición de unidad de especificación Una unidad se define como la cantidad de enzima necesaria para digerir 1 µg de ADN λ en 1 hora a 55 °C en un volumen de reacción total de 50 μl. Condiciones de reacción 1X NEBuffer™ r3.1 Incubar a 55 °C 1X NEBuffer™ r3.1 100 mM NaCl 50 mM Tris-HCl 10 mM MgCl2 100 µg/ml Albúmina recombinante (pH 7,9 a 25 °C) Concentración de uso 1X Actividad en NEBuffers NEBuffer™ r1.1: <10 % NEBuffer™ r2.1: 50 % NEBuffer™ r3.1: 100 % Tampón rCutSmart™: 25 % Compatibilidad del diluyente Diluyente B Tampón de almacenamiento 10 mM Tris-HCl 300 mM NaCl 1 mM DTT 0,1 mM EDTA 500 µg/ml Albúmina recombinante 50 % Glicerol pH 7,4 a 25 °C Inactivación por calor 80 °C durante 20 minutos Sensibilidad a la metilación dam metilación: No sensible dcm metilación: No sensible CpG metilación: Bloqueada Actividad a temperatura a 37 °C: 10 % Preguntas frecuentes P: ¿Por qué hay un sitio BsmBI en LITMUS 38 pero no en LITMUS 39? R: El sitio BsmBI en LITMUS 38 resultó de la consecuencia de sitios de restricción adyacentes para enzimas de clonación comunes en el polienlazador. P: ¿Qué enzimas de restricción se utilizan en el ensamblaje Golden Gate? R: El ensamblaje Golden Gate es un método de clonación eficiente en un solo tubo basado en enzimas de restricción de tipo IIS que escinden fuera de sus sitios de reconocimiento y dejan salientes de 3 o 4 bases. BsaI es la enzima de tipo IIS más comúnmente utilizada para el ensamblaje Golden Gate. NEB también ofrece una versión de alta fidelidad de esta enzima, BsaI-HF®v2, que cuenta con la ventaja adicional de estar certificada como Time-Saver™ (puede digerir ADN en 5-15 minutos o durante la noche sin degradarlo) y presenta una actividad estrella drásticamente reducida. Otras enzimas de tipo IIS utilizadas en el ensamblaje Golden Gate incluyen BsmBI-v2/Esp3I, BbsI/BbsI-HF, PaqCI (isoesquizómero AarI con secuencia de reconocimiento de 7 pb) y SapI/BspQI/BspQI-HF (con secuencia de reconocimiento de 7 pb y salientes de 3 pb). P: ¿Qué enzimas de restricción se utilizan en el ensamblaje GoldenBraid? R: BsaI es una enzima de tipo IIS utilizada en este método. NEB también ofrece una versión de alta fidelidad diseñada de esta enzima, BsaI-HF®v2, que tiene la ventaja adicional de estar calificada para Time-Saver™ (puede digerir ADN en 5-15 minutos y puede digerirse de forma segura durante la noche) y exhibe una actividad estrella reducida. BsaI-HFv2 funciona en el tampón CutSmart®, al igual que la ADN ligasa T4 (también parte del flujo de trabajo GoldenBraid), que es 100% funcionalmente activa en este tampón, cuando la reacción se complementa con 1 mM de ATP. Otras enzimas de tipo IIS utilizadas en GoldenBraid incluyen BsmBI-v2/Esp3I, BtgZI, BbsI/BbsI-HF y PaqCI (isoesquizómero AarI con secuencia de reconocimiento de 7 pb). Referencia: GoldenBraid 2.0: Un marco integral de ensamblaje de ADN para la biología sintética de plantas P: ¿Cuándo es la actividad estrella un problema? R: La actividad estrella es preocupante si las bandas adicionales pueden causar una interpretación errónea de los resultados en los procedimientos de genotipado y análisis mutacional. El diseño experimental puede promover la actividad estrella. Los volúmenes de reacción pequeños tienen más probabilidades de contener concentraciones de glicerol del 5% o superiores, una condición que se sabe que aumenta la actividad estrella. Una concentración de glicerol del 5% ocurre cuando se configura una digestión doble en una reacción de 20 µl usando 1 µl de cada enzima. Las digestiones nocturnas tienen más probabilidades de generar actividad estrella. Para obtener consejos sobre cómo evitar la actividad estrella, haga clic aquí. P: ¿Cuántos nucleótidos tengo que agregar adyacentes al sitio de reconocimiento de RE para obtener un corte eficiente? R: Protocolo de digestión con enzimas de restricción: corte cerca del extremo del ADN P: ¿Qué enzimas de restricción NEB se suministran con el colorante de carga de gel, púrpura (6X)? R: Todas las enzimas de restricción HF y la mayoría de las enzimas de restricción NEB no HF se suministran con el colorante de carga de gel, púrpura (6X). Las enzimas de restricción no HF que vienen suministradas con el tinte púrpura son: AatII AsiSI BsmBI-v2 EagI MboI NlaIII PvuI SmaI Acil AvrII BspHI EcoRI MboII NotI RsaI SpeI AfeI BamHI BsrGI EcoRV MluI NspI SacI StuI AflII BbsI ClaI Esp3I FseI MseI PacI SacII AgeI BglII DdeI HaeIII MspI PciI SalI XbaI AluI BsaI DpnI HindIII NcoI PmeI SapI XhoI ApaI BseYI DpnII HpaI NdeI PsiI-v2 SfaNI XmaI ApeKI BsiWI DraI KpnI NheI PstI SfiI XmnI AscI * Todas las enzimas de restricción HF también se suministran con tinte de carga en gel, morado (6X) P: ¿Puedes contarme más? ¿Qué opina sobre el cambio de BSA a albúmina recombinante (rAlbúmina) en los NEBuffers? R: NEB se complace en anunciar que hemos cambiado los tampones de reacción con BSA (NEBuffer 1.1, 2.1, 3.1 y CutSmart® Buffer) por tampones con albúmina recombinante (NEBuffer r1.1, r2.1, r3.1 y rCutSmart™ Buffer). También estamos en proceso de cambiar todas las formulaciones de enzimas de restricción para que contengan rAlbúmina. Creemos que dejar de usar productos de origen animal es un paso en la dirección correcta y podemos ofrecer esta mejora al mismo precio. P: ¿Cuáles son las diferencias entre BsmBI-v2 y su isoesquizómero, Esp3I? R: BsmBI-v2 es una enzima de restricción de tipo IIS que requiere incubación a 55 °C y se suministra con NEBuffer r3.1. Esp3i es un isoesquizómero de BsmBI-v2 que requiere incubación a 37 °C y se suministra con el tampón rCutSmart™ (con rCutSmart se suministran más de 210 enzimas de restricción). Ambas enzimas se utilizan en el ensamblaje Golden Gate. P: ¿Es compatible el colorante de carga de gel púrpura (6X) o el colorante de carga de gel púrpura (6X) sin SDS con otros colorantes de unión al ADN como SYBR® y GelRed™ durante la electroforesis en gel? R: Dado que los colorantes de alta afinidad para la unión de ácidos nucleicos pueden afectar la migración del ADN durante la electroforesis, se recomienda encarecidamente la tinción posterior de los geles con colorantes SYBR o GelRed. Sin embargo, estos colorantes también se pueden utilizar como colorantes prefabricados (en el gel de agarosa). Dado que el colorante de carga de gel púrpura (6X) tiene una mayor concentración en SDS, se pueden observar interferencias al utilizar SYBR o GelRed como colorantes prefabricados. Al usar estos colorantes como colorantes prefabricados, NEB recomienda usar nuestro colorante de carga de gel, púrpura, sin SDS (6X) (NEB n.º B7025S) en su lugar. Siga las recomendaciones a continuación para ambos colorantes púrpura cuando use colorantes SYBR como colorantes prefabricados: reduzca la cantidad de ADN de muestra cargado a 250 a 500 ng y use solo 0,5X de colorantes SYBR en geles prefabricados. Estos colorantes son mucho más sensibles que el EtBr. Las bandas reventadas o manchadas pueden deberse a una sobrecarga. Si usa el colorante de carga de gel, púrpura (6X) B7024S, use TBE en lugar del tampón TAE, ya que la interferencia de SDS aumenta cuando se usa el tampón TAE (en el gel y como tampón de ejecución). Use los colorantes SYBR según lo recomendado por el fabricante: agregue primero el colorante SYBR al tampón TBE y luego agregue la mezcla de colorante SYBR/TBE a la solución de agarosa fundida. Es preferible esperar unos minutos para agregar los colorantes SYBR a la agarosa fundida. Agregarlo a una solución de agarosa fría (por encima de la temperatura de gelificación, 45 °C) produce mejores resultados. Siempre ejecute un gel de agarosa recién hecho, para una sola ejecución. Volver a ejecutar el gel producirá un resultado deficiente. Siga las recomendaciones a continuación para ambos colorantes púrpura cuando use colorantes GelRed como colorantes prefabricados: Reduzca la cantidad de ADN de muestra cargado a 60 a 125 ng y use solo 0,5X de colorante GelRed en geles prefabricados. Este colorante es mucho más sensible que EtBr. Las bandas quemadas o manchadas pueden deberse a una sobrecarga. Es preferible esperar unos minutos para agregar el colorante GelRed a la agarosa fundida. Agregarlo a una solución de agarosa fría (por encima de la temperatura de gelificación, 45 °C) produce mejores resultados. Siempre ejecute un gel de agarosa recién hecho, para una sola ejecución. Volver a analizar el gel dará como resultado un resultado deficiente. SYBR® es una marca registrada de Life Technologies Corporation. GelRed™ es una marca registrada de Biotium.