Laboratorios Biológicos de Nueva Inglaterra, R0744S, PsiI-v2

PsiI-v2 ha sido reformulado con albúmina recombinante (rAlbúmina) a partir del lote n.º 10258634. Categorías relacionadas Endonucleasas de restricción Aplicaciones de PR Preparación de ADN, Análisis de ADN, Digestión con enzimas de restricción Unidad de especificación Definición Una unidad se define como la cantidad de enzima necesaria para digerir 1 µg de ADN λ en 1 hora a 37 °C en un volumen de reacción total de 50 μl. Condiciones de reacción Tampón rCutSmart™ 1X Incubar a 37 °C Tampón rCutSmart™ 1X Acetato de potasio 50 mM Tris-acetato 20 mM Acetato de magnesio 10 mM Albúmina recombinante 100 µg/ml (pH 7,9 a 25 °C) Actividad en tampones NE Tampón NE™ r1.1: 25 % Tampón NE™ r2.1: 50 % Tampón NE™ r3.1: 10 % Tampón rCutSmart™: 100 % Compatibilidad del diluyente Diluyente B Tampón de almacenamiento Tris-HCl 10 mM NaCl 300 mM DTT 1 mM EDTA 0,1 mM Albúmina recombinante 50 % Glicerol pH 7,4 @ 25 °C Inactivación por calor 65 °C durante 20 minutos Sensibilidad a la metilación dam metilación: No sensible dcm metilación: No sensible CpG metilación: No sensible Preguntas frecuentes P: ¿Cuándo es una preocupación la actividad estrella? R: La actividad estrella es preocupante si las bandas adicionales pueden causar una mala interpretación de los resultados en los procedimientos de genotipado y análisis mutacional. El diseño experimental puede promover la actividad estrella. Es más probable que los volúmenes de reacción pequeños contengan concentraciones de glicerol del 5% o más, una condición que se sabe que aumenta la actividad estrella. Una concentración de glicerol del 5% ocurre cuando se configura una digestión doble en una reacción de 20 µl usando 1 µl de cada enzima. Es más probable que las digestiones nocturnas generen actividad estrella. Para obtener consejos sobre cómo evitar la actividad estrella, haga clic aquí. P: ¿Qué enzimas de restricción NEB se suministran con el colorante de carga de gel, púrpura (6X)? R: Todas las enzimas de restricción HF y la mayoría de las enzimas de restricción NEB no HF se suministran con colorante de carga de gel, púrpura (6X). Las enzimas de restricción no HF que vienen suministradas con el tinte púrpura son: AatII AsiSI BsmBI-v2 EagI MboI NlaIII PvuI SmaI Acil AvrII BspHI EcoRI MboII NotI RsaI SpeI AfeI BamHI BsrGI EcoRV MluI NspI SacI StuI AflII BbsI ClaI Esp3I FseI MseI PacI SacII AgeI BglII DdeI HaeIII MspI PciI SalI XbaI AluI BsaI DpnI HindIII NcoI PmeI SapI XhoI ApaI BseYI DpnII HpaI NdeI PsiI-v2 SfaNI XmaI ApeKI BsiWI DraI KpnI NheI PstI SfiI XmnI AscI * Todas las enzimas de restricción HF también se suministran con tinte de carga en gel, morado (6X) P: ¿Esta enzima es sensible a ¿Metilación de CpG en dam, dcm o mamíferos? R: No. Esta enzima no es sensible a la metilación de CpG en dam, dcm ni mamíferos. Para obtener información actualizada sobre la sensibilidad a la metilación, visite Dam-Dcm y metilación de CpG o REBASE. P: Probé su enzima de restricción en el ADN sustrato recomendado por NEB y parece estar activo; sin embargo, no digiere mi ADN. ¿Cuál podría ser la razón? R: La calidad y la limpieza del ADN son factores importantes que pueden afectar la actividad enzimática. Las enzimas de restricción activas en el tampón rCutSmart®, pero no tan activas en el tampón NE r2.1 o r3.1 (nuestros tampones con mayor concentración de sal), pueden verse inhibidas por la sal presente en la reacción. Los procedimientos de purificación de ADN que utilizan columnas de centrifugación pueden generar soluciones de ADN con niveles significativos de sal que pueden transferirse a la reacción e inhibir la actividad enzimática. Para evitar esto, recomendamos que la solución de ADN añadida a la reacción no supere el 25 % del volumen total de la reacción. Esto se puede lograr ajustando el volumen total de reacción según corresponda. P: ¿Pueden contarme más sobre el cambio de BSA a albúmina recombinante (rAlbúmina) en los tampones NEBuffer? R: En NEB nos complace anunciar que hemos cambiado los tampones de reacción con BSA (NEBuffer 1.1, 2.1, 3.1 y CutSmart® Buffer) por tampones con albúmina recombinante (NEBuffer r1.1, r2.1, r3.1 y rCutSmart™ Buffer). También estamos en proceso de cambiar todas las formulaciones de enzimas de restricción para que contengan rAlbúmina. Creemos que dejar de usar productos de origen animal es un paso en la dirección correcta y podemos ofrecer esta mejora al mismo precio. P: ¿Se puede almacenar el colorante de carga de gel, púrpura 6X (B7024) a bajas temperaturas? R: La temperatura de almacenamiento recomendada para el colorante de carga de gel, púrpura 6X, es temperatura ambiente (25 °C). Comúnmente, el SDS puede precipitar de la solución cuando el tinte se almacena a bajas temperaturas. Este ligero precipitado se puede disipar dejando reposar el vial a temperatura ambiente durante una hora o calentándolo suavemente durante 10 minutos. Mezcle el vial varias veces antes de usarlo para que la solución vuelva a la homogeneidad. P: ¿Es el Gel Loading Dye, Purple (6X) o el Gel Loading Dye, Purple (6X), sin SDS compatible con otros tintes de unión al ADN como SYBR® y GelRed™ durante la electroforesis en gel? R: Debido a que los tintes de unión a ácidos nucleicos de alta afinidad pueden afectar la migración del ADN durante la electroforesis, se recomienda encarecidamente la tinción posterior de los geles con tintes SYBR o GelRed. Sin embargo, estos tintes también se pueden usar como tintes prefabricados (en el gel de agarosa). Debido a que el Gel Loading Dye, Purple (6X) tiene una mayor concentración en SDS, se puede observar cierta interferencia al usar SYBR o GelRed como tintes prefabricados. Al usar estos colorantes como colorantes prefabricados, NEB recomienda usar nuestro colorante de carga de gel, púrpura, sin SDS (6X) (NEB n.º B7025S) en su lugar. Siga las recomendaciones a continuación para ambos colorantes púrpura cuando use colorantes SYBR como colorantes prefabricados: reduzca la cantidad de ADN de muestra cargado a 250 a 500 ng y use solo 0,5X de colorantes SYBR en geles prefabricados. Estos colorantes son mucho más sensibles que el EtBr. Las bandas reventadas o manchadas pueden deberse a una sobrecarga. Si usa el colorante de carga de gel, púrpura (6X) B7024S, use TBE en lugar del tampón TAE, ya que la interferencia de SDS aumenta cuando se usa el tampón TAE (en el gel y como tampón de ejecución). Use los colorantes SYBR según lo recomendado por el fabricante: agregue primero el colorante SYBR al tampón TBE y luego agregue la mezcla de colorante SYBR/TBE a la solución de agarosa fundida. Es preferible esperar unos minutos para agregar los colorantes SYBR a la agarosa fundida. Agregarlo a una solución de agarosa fría (por encima de la temperatura de gelificación, 45 °C) produce mejores resultados. Siempre ejecute un gel de agarosa recién hecho, para una sola ejecución. Volver a ejecutar el gel producirá un resultado deficiente. Siga las recomendaciones a continuación para ambos colorantes púrpura cuando use colorantes GelRed como colorantes prefabricados: Reduzca la cantidad de ADN de muestra cargado a 60 a 125 ng y use solo 0,5X de colorante GelRed en geles prefabricados. Este colorante es mucho más sensible que EtBr. Las bandas quemadas o manchadas pueden deberse a una sobrecarga. Es preferible esperar unos minutos para agregar el colorante GelRed a la agarosa fundida. Agregarlo a una solución de agarosa fría (por encima de la temperatura de gelificación, 45 °C) produce mejores resultados. Siempre ejecute un gel de agarosa recién hecho, para una sola ejecución. Volver a analizar el gel dará como resultado un resultado deficiente. SYBR® es una marca registrada de Life Technologies Corporation. GelRed™ es una marca registrada de Biotium.