Laboratorios biológicos de Nueva Inglaterra, R0745L, PaqCI®

PaqCI ha sido reformulado con albúmina recombinante (rAlbúmina) a partir del lote n.º 10211228. Categorías relacionadas Endonucleasas de restricción Aplicaciones de PR Soluciones de automatización y clonación de alto rendimiento, Especificación del conjunto NEBridge® Golden Gate Definición de unidad Una unidad se define como la cantidad de enzima necesaria para digerir 1 µg de ADN λ en 1 hora a 37 °C en un volumen de reacción total de 50 μl. Condiciones de reacción Suplemento de tampón rCutSmart™ 1X con activador PaqCI Incubar a 37 °C Tampón rCutSmart™ Acetato de potasio 50 mM Tris-acetato 20 mM Acetato de magnesio 10 mM Albúmina recombinante 100 µg/ml (pH 7,9 a 25 °C) Actividad en tampones NE Tampón NE™ r1.1: 10 % Tampón NE™ r2.1: 100 % Tampón NE™ r3.1: 10 % Tampón rCutSmart™: 100 % Compatibilidad del diluyente Diluyente B Tampón de almacenamiento Tris-HCl 10 mM NaCl 300 mM DTT 1 mM 500 µg/ml Albúmina recombinante 50 % Glicerol pH 7,4 a 25 °C Inactivación por calor 65 °C durante 20 minutos Sensibilidad a la metilación dam metilación: No sensible dcm metilación: No sensible Metilación CpG: Deteriorada por superposición Preguntas frecuentes P: ¿Qué enzimas de restricción se utilizan en el ensamblaje Golden Gate? R: El ensamblaje Golden Gate es un método de clonación eficiente en un solo tubo basado en enzimas de restricción de tipo IIS que escinden fuera de sus sitios de reconocimiento y dejan salientes de 3 o 4 bases. BsaI es la enzima de tipo IIS más utilizada para el ensamblaje Golden Gate. NEB también ofrece una versión de alta fidelidad diseñada de esta enzima, BsaI-HF®v2, que tiene el beneficio adicional de estar calificada para Time-Saver™ (puede digerir ADN en 5-15 minutos o durante la noche sin degradación al ADN) y exhibe una actividad estrella drásticamente reducida. Otras enzimas de tipo IIS utilizadas en el ensamblaje Golden Gate incluyen BsmBI-v2/Esp3I, BbsI/BbsI-HF, PaqCI (isoesquizómero AarI con secuencia de reconocimiento de 7 pb) y SapI/BspQI/BspQI-HF (con secuencia de reconocimiento de 7 pb y salientes de 3 pb). P: ¿Qué enzimas de restricción se utilizan en el ensamblaje GoldenBraid? R: BsaI es una enzima de tipo IIS utilizada en este método. NEB también ofrece una versión de alta fidelidad de esta enzima, BsaI-HF®v2, que cuenta con la ventaja adicional de estar certificada por Time-Saver™ (puede digerir el ADN en 5-15 minutos y se puede digerir de forma segura durante la noche) y presenta una actividad estrella reducida. BsaI-HFv2 funciona en el tampón CutSmart®, al igual que la ADN ligasa T4 (también parte del flujo de trabajo GoldenBraid), que es 100 % activa funcionalmente en este tampón cuando la reacción se complementa con 1 mM de ATP. Otras enzimas de tipo IIS utilizadas en GoldenBraid incluyen BsmBI-v2/Esp3I, BtgZI, BbsI/BbsI-HF y PaqCI (isoesquizómero AarI con secuencia de reconocimiento de 7 pb). Referencia: GoldenBraid 2.0: Un marco integral de ensamblaje de ADN para la biología sintética de plantas. P: ¿Cuándo es preocupante la actividad estrella? R: La actividad estrella es preocupante si las bandas adicionales pueden causar una interpretación errónea de los resultados en los procedimientos de genotipado y análisis mutacional. El diseño experimental puede promover la actividad estrella. Es más probable que los volúmenes de reacción pequeños contengan concentraciones de glicerol del 5 % o superiores, una condición que se sabe que aumenta la actividad estrella. Se produce una concentración de glicerol del 5 % al configurar una digestión doble en una reacción de 20 µl con 1 µl de cada enzima. Las digestaciones nocturnas tienen más probabilidades de generar actividad estrella. Para obtener consejos sobre cómo evitar la actividad estrella, haga clic aquí. P: ¿Por qué PaqCI no corta el ADN completamente? R: PaqCI es una enzima que requiere múltiples sitios de reconocimiento para lograr una digestión completa. Por lo tanto, NEB ha incluido el "Activador PaqCI", que puede añadirse a la reacción en una proporción de 1:1 (es decir, 1 µl de enzima por 1 µl de Activador PaqCI). Tenga en cuenta que, para las reacciones de ensamblaje Golden Gate, la cantidad de Activador PaqCI varía en función de la cantidad de fragmentos que se ensamblen. Para obtener más información, consulte las Instrucciones de uso para el ensamblaje Golden Gate con PaqCI. P: ¿Pueden darme más información sobre el cambio de BSA a albúmina recombinante (rAlbúmina) en los NEBuffers? R: NEB se complace en anunciar que hemos cambiado los tampones de reacción que contienen BSA (NEBuffer 1.1, 2.1, 3.1 y CutSmart® Buffer) por tampones que contienen albúmina recombinante (NEBuffer r1.1, r2.1, r3.1 y rCutSmart™ Buffer). También estamos en proceso de adaptar todas las formulaciones de enzimas de restricción para que contengan rAlbúmina. Consideramos que dejar de usar productos con ingredientes de origen animal es un paso en la dirección correcta y podemos ofrecer esta mejora al mismo precio. P: Para el ensamblaje Golden Gate, ¿cuántos pares de bases deben tener mis insertos de amplicón flanqueando el sitio de restricción PaqCI? R: Los insertos de amplicón deben tener bases flanqueantes en el extremo 5' y sitios de restricción PaqCI en ambos extremos del amplicón con la orientación correcta. Recomendamos agregar 6 bases flanqueantes en el extremo 5' de los cebadores para una óptima unión y escisión de PaqCI, y una eficiencia general del ensamblaje Golden Gate. Esta recomendación de 6 pares de bases reemplaza otras preferencias conocidas de longitud de extremo para la enzima, debido a que los protocolos de ensamblaje Golden Gate requieren la máxima actividad enzimática para un ensamblaje eficiente.