Laboratorios biológicos de Nueva Inglaterra, R3138L, SalI-HF®

SalI-HF ha sido reformulado con albúmina recombinante (rAlbúmina) a partir del lote n.º 10223617. Categorías relacionadas Endonucleasas de restricción S,, Endonucleasas de restricción de alta fidelidad (HF®),, Enzimas de restricción calificadas que ahorran tiempo Aplicaciones Especificación de digestión con enzimas de restricción Definición de unidad Una unidad se define como la cantidad de enzima necesaria para digerir 1 μg de ADN λ (digestión con HindIII) en 1 hora a 37 °C en un volumen de reacción total de 50 μl. Condiciones de reacción Tampón rCutSmart™ 1X Incubar a 37 °C Tampón rCutSmart™ 1X Acetato de potasio 50 mM Tris-acetato 20 mM Acetato de magnesio 10 mM Albúmina recombinante 100 µg/ml (pH 7,9 a 25 °C) Actividad en tampones NE Tampón NE™ r1.1: 10 % Tampón NE™ r2.1: 100 % Tampón NE™ r3.1: 100 % Tampón rCutSmart™: 100 % Compatibilidad del diluyente Diluyente A Tampón de almacenamiento Tris-HCl 10 mM KCl 50 mM DTT 1 mM EDTA 0,1 mM Glicerol al 50 % 300 µg/ml Albúmina recombinante pH 7,5 a 25 °C Inactivación por calor 65 °C durante 20 minutos Sensibilidad a la metilación dam metilación: No sensible dcm metilación: No sensible Metilación de CpG: Bloqueada Preguntas frecuentes P: ¿Hay alguna diferencia en la sensibilidad a la metilación entre SalI-HF y SalI? R: Tanto SalI-HF como SalI se ven afectadas por una hemimetilación de CpG de mamíferos superpuesta y bloqueadas por una metilación más extensa. Para obtener información más específica sobre la metilación, siga el enlace a la base de datos de enzimas de restricción REBASE. P: ¿Cómo se compara el nivel de actividad estrella de SalI-HF con SalI? R: El índice de fidelidad que mide las unidades mínimas para producir actividad estrella se determinó utilizando las siguientes condiciones; 1X NEBuffer, 5% de glicerol, digestión de lambda ADN HindIII (1 µg/50 µl), incubado durante 1 hora a 37 °C. El número mínimo de unidades de SalI-HF requeridas para producir actividad estrella en el rCutSmart Buffer™ recomendado es (≥2,000 unidades). El número mínimo de unidades de SalI requeridas para producir actividad estrella en el NEBuffer r3.1 recomendado es (4 unidades). El número mínimo de unidades de SalI requeridas para producir actividad estrella en el rCutSmart Buffer es (0.03 unidades). P: ¿Cuál es la diferencia entre SalI-HF y SalI? R: SalI-HF se produce en E. coli a partir de una cepa que porta el gen SalI clonado y modificado de Streptomyces albus G (ATCC 49789). P: ¿Por qué la versión HF de la enzima tiene un tampón recomendado diferente al de la enzima de tipo silvestre? R: En muchos casos, cambiar los aminoácidos cargados de un gen de endonucleasa de restricción resulta en cambios en la preferencia del tampón. Estos cambios pueden ser significativos. Por ejemplo, la SalI de tipo silvestre tiene un requisito estricto para NEBuffer r3.1, un tampón de alta fuerza iónica. Sin embargo, SalI-HF funciona bien en NEBuffer r2.1 y rCutSmart Buffer™, que son tampones de fuerza iónica moderada. P: ¿Cuándo debo elegir la versión HF de una enzima? R: La versión HF de la enzima tiene la misma especificidad de escisión que la enzima de tipo salvaje y debe elegirse si la actividad estrella es una preocupación o si el tampón recomendado es más conveniente para la digestión doble u otro protocolo de varios pasos. No hay ninguna desventaja en usar la versión HF. P: ¿Cuándo es una preocupación la actividad estrella? R: La actividad estrella es una preocupación si las bandas adicionales pueden causar una interpretación errónea de los resultados en los procedimientos de genotipado y análisis mutacional. El diseño experimental puede promover la actividad estrella. Los volúmenes de reacción pequeños tienen más probabilidades de contener concentraciones de glicerol del 5% o superiores, una condición que se sabe que aumenta la actividad estrella. Una concentración de glicerol del 5% ocurre cuando se configura una digestión doble en una reacción de 20 µl usando 1 µl de cada enzima. Las digestiones nocturnas tienen más probabilidades de generar actividad estrella. Para obtener consejos sobre cómo evitar la actividad estrella, haga clic aquí. P: ¿Cuándo debo elegir la versión de alta fidelidad (HF®) de la enzima? R: La versión HF de la enzima tiene la misma especificidad de escisión que la enzima de tipo silvestre y debe elegirse si la actividad estrella es una preocupación o si el tampón recomendado, CutSmart®, es más conveniente para la digestión doble u otro protocolo de varios pasos. En algunos casos, las enzimas HF pueden tener diferente temperatura (o tiempo) de inactivación térmica, tolerancia a la sal y (raramente) propiedades de metilación. Obtenga más información sobre las enzimas de restricción de alta fidelidad. P: ¿Puede ser ventajoso el cambio en la preferencia de tampón de la enzima HF? R: Todas las enzimas de restricción HF se suministran con el tampón rCutSmart®. Las enzimas HF suelen tener un tampón óptimo diferente al de la enzima de tipo silvestre; esto puede ser ventajoso al diseñar experimentos de digestión doble. Se eligió el tampón rCutSmart como el tampón recomendado para las enzimas HF, ya que muestra el mayor nivel de compatibilidad enzimática en el sistema de tampón NEB. P: ¿La enzima HF producirá una actividad estrella elevada al usarse en un tampón distinto al recomendado? R: La actividad estrella se probó exhaustivamente en todos los NEBuffers que mostraron al menos un 50% de actividad enzimática. La actividad estrella se reduce significativamente en comparación con la actividad enzimática de tipo salvaje en todos los NEBuffers. Sin embargo, recomendamos usar el tampón de reacción sugerido siempre que sea posible, ya que hay casos en los que la actividad estrella aún puede ser problemática en condiciones extremas utilizando tampones no recomendados. P: ¿Cómo se cuantifica la mejora en la fidelidad de las endonucleasas de restricción HF? R: La actividad estrella se mide utilizando un Índice de Fidelidad (IF). El IF de la endonucleasa de restricción de tipo salvaje se puede comparar directamente con la versión HF modificada. P: ¿Qué es el Índice de Fidelidad (IF)? R: “El Índice de Fidelidad (IF) se define como la relación entre la cantidad máxima de enzima que no muestra actividad estrella y la cantidad mínima necesaria para la digestión completa en el sitio de reconocimiento cognado para cualquier endonucleasa de restricción en particular”. El valor de IF se traduce en el número mínimo de unidades que se requirió para producir actividad estrella. El valor de FI puede verse influenciado por el sustrato, el tampón y aditivos como el glicerol. La siguiente referencia explica cómo se determina el Índice de Fidelidad. Hua Wei et. al. “El Índice de Fidelidad proporciona una cuantificación sistemática de la actividad estrella de las endonucleasas de restricción de ADN”, Nucleic Acids Research, 2008, Vol. 36, N.º 9: e50. P: ¿A qué se refiere HF® después del nombre de una enzima de restricción? R: HF® significa alta fidelidad. Muchas endonucleasas de restricción son capaces de escindir secuencias similares, pero no idénticas, a su secuencia de reconocimiento definida. Esta especificidad alterada o relajada se ha denominado actividad estrella. Las endonucleasas de restricción HF se han diseñado para escindir con mayor fidelidad que la enzima de tipo silvestre, por lo que presentan una menor actividad estrella. Se utilizaron pantallas que utilizan una mayor concentración de glicerol, un mayor tiempo de reacción y una alta concentración de enzima para identificar las enzimas que ofrecerían la más alta fidelidad en una amplia gama de condiciones. Además, todas las enzimas HF se suministran con rCutSmart Buffer™, así como un vial gratuito de colorante de carga púrpura. Obtenga más información sobre las enzimas de restricción de alta fidelidad aquí. P: ¿Tengo que configurar las digestiones con enzimas calificadas Time-Saver™ durante 5 a 15 minutos? ¿Puedo digerir por más tiempo? R: Las enzimas Time-Saver™ de NEB tienen la ventaja de trabajar rápido (5-15 minutos), pero también están diseñadas y calificadas para soportar digestiones durante la noche sin degradación del ADN. P: ¿Se puede almacenar el colorante de carga de gel, púrpura 6X (B7024) a bajas temperaturas? R: La temperatura de almacenamiento recomendada para el colorante de carga de gel, púrpura 6X, es temperatura ambiente (25 °C). Comúnmente, el SDS puede precipitar de la solución cuando el colorante se almacena a bajas temperaturas. Este ligero precipitado se puede disipar dejando reposar el vial a temperatura ambiente durante una hora o calentándolo suavemente durante 10 minutos. Mezcle el vial varias veces antes de usarlo para homogeneizar la solución. P: ¿Qué significa la certificación Time-Saver™? R: Las enzimas con certificación Time-Saver digieren el sustrato de ensayo unitario en 5-15 minutos en las condiciones de reacción recomendadas y también se pueden usar de forma segura en las digestiones nocturnas. P: ¿Puede contarme más sobre el cambio de BSA a albúmina recombinante (rAlbúmina) en NEBuffers? R: NEB se complace en anunciar que hemos cambiado los tampones de reacción que contienen BSA (NEBuffer 1.1, 2.1, 3.1 y CutSmart® Buffer) a tampones que contienen albúmina recombinante (NEBuffer r1.1, r2.1, r3.1 y rCutSmart™ Buffer). También estamos en proceso de cambiar todas las formulaciones de enzimas de restricción para que contengan albúmina recombinante. Creemos que dejar de usar productos de origen animal es un paso en la dirección correcta y podemos ofrecer esta mejora al mismo precio. P: ¿Es compatible el colorante de carga de gel, púrpura (6X) o el colorante de carga de gel, púrpura (6X), sin SDS, con otros colorantes de unión al ADN como SYBR® y GelRed™ durante la electroforesis en gel? R: Debido a que los colorantes de unión a ácidos nucleicos de alta afinidad pueden afectar la migración del ADN durante la electroforesis, se recomienda encarecidamente la tinción posterior de los geles con colorantes SYBR o GelRed. Sin embargo, estos colorantes también se pueden usar como colorantes prefabricados (en el gel de agarosa). Debido a que el colorante de carga de gel, púrpura (6X) tiene una mayor concentración en SDS, se pueden observar algunas interferencias al usar SYBR o GelRed como colorantes prefabricados. Al usar estos colorantes como colorantes prefabricados, NEB recomienda usar nuestro colorante de carga de gel, púrpura, sin SDS (6X) (NEB n.º B7025S) en su lugar. Siga las recomendaciones a continuación para ambos colorantes púrpura cuando use colorantes SYBR como colorantes prefabricados: reduzca la cantidad de ADN de muestra cargado a 250 a 500 ng y use solo 0,5X de colorantes SYBR en geles prefabricados. Estos colorantes son mucho más sensibles que el EtBr. Las bandas reventadas o manchadas pueden deberse a una sobrecarga. Si usa el colorante de carga de gel, púrpura (6X) B7024S, use TBE en lugar del tampón TAE, ya que la interferencia de SDS aumenta cuando se usa el tampón TAE (en el gel y como tampón de ejecución). Use los colorantes SYBR según lo recomendado por el fabricante: agregue primero el colorante SYBR al tampón TBE y luego agregue la mezcla de colorante SYBR/TBE a la solución de agarosa fundida. Es preferible esperar unos minutos para agregar los colorantes SYBR a la agarosa fundida. Agregarlo a una solución de agarosa fría (por encima de la temperatura de gelificación, 45 °C) produce mejores resultados. Siempre ejecute un gel de agarosa recién hecho, para una sola ejecución. Volver a ejecutar el gel producirá un resultado deficiente. Siga las recomendaciones a continuación para ambos colorantes púrpura cuando use colorantes GelRed como colorantes prefabricados: Reduzca la cantidad de ADN de muestra cargado a 60 a 125 ng y use solo 0,5X de colorante GelRed en geles prefabricados. Este colorante es mucho más sensible que EtBr. Las bandas quemadas o manchadas pueden deberse a una sobrecarga. Es preferible esperar unos minutos para agregar el colorante GelRed a la agarosa fundida. Agregarlo a una solución de agarosa fría (por encima de la temperatura de gelificación, 45 °C) produce mejores resultados. Siempre ejecute un gel de agarosa recién hecho, para una sola ejecución. Volver a analizar el gel dará como resultado un resultado deficiente. SYBR® es una marca registrada de Life Technologies Corporation. GelRed™ es una marca registrada de Biotium.