Laboratorios biológicos de Nueva Inglaterra, R3140L, PstI-HF®

PstI-HF ha sido reformulado con albúmina recombinante (rAlbúmina) comenzando con el lote n.º 10227210. Categorías relacionadas Endonucleasas de restricción PR,, Endonucleasas de restricción de alta fidelidad (HF®),, Enzimas de restricción calificadas que ahorran tiempo Aplicaciones Clonación rápida: acelere sus flujos de trabajo de clonación con reactivos de NEB,, Definición de unidad de especificación de digestión con enzimas de restricción Una unidad se define como la cantidad de enzima necesaria para digerir 1 µg de ADN λ en 1 hora a 37 °C en un volumen de reacción total de 50 μl. Condiciones de reacción Tampón rCutSmart™ 1X Incubar a 37 °C Tampón rCutSmart™ 1X Acetato de potasio 50 mM Tris-acetato 20 mM Acetato de magnesio 10 mM Albúmina recombinante 100 µg/ml (pH 7,9 a 25 °C) Actividad en tampones NE Tampón NE™ r1.1: 10 % Tampón NE™ r2.1: 75 % Tampón NE™ r3.1: 50 % Tampón rCutSmart™: 100 % Compatibilidad del diluyente Diluyente C Tampón de almacenamiento Tris-HCl 10 mM NaCl 250 mM DTT 1 mM EDTA 0,1 mM 200 µg/ml Albúmina recombinante 50 % Glicerol 0,15 % Triton® X-100 pH 7,4 a 25 °C Inactivación por calor Sin sensibilidad a la metilación Metilación en dam: no sensible Metilación en dcm: no sensible Metilación en CpG: no sensible Preguntas frecuentes P: ¿Existe alguna diferencia en la sensibilidad a la metilación entre PstI-HF y PstI? R: Ni PstI-HF ni PstI son sensibles a la metilación en dam, dcm o CpG de mamíferos. Para obtener información más específica sobre la metilación, siga el enlace a la base de datos de enzimas de restricción REBASE. P: ¿Cuál es la diferencia entre PstI-HF y PstI? R: PstI-HF se produce en E. coli a partir de una cepa que porta el gen PstI clonado y modificado de Providencia stuartii164 (ATCC 49762). P: ¿La metilación bloquea PstI? R: PstI no se bloquea mediante la metilación en Dam, Dcm o CpG. Sin embargo, PstI es bloqueado por ciertos tipos de metilación que a veces se encuentran en el ADN de las plantas. Las plantas a menudo tienen metilación CAG y/o CTG que conduce a sitios MTG y/o MAG. Donde M es 5mC. Pst I es bloqueado por este tipo de metilación. Esto no es lo mismo que la metilación CpG (MG en lugar de MTG y MAG). Para obtener información actualizada sobre las sensibilidades de metilación, visite Dam-Dcm y metilación CpG o REBASE. Pst I tampoco cortará AGCTGCAG cuando sea metilado por la metilasa AluI. P: ¿Cómo se compara el nivel de actividad estrella de PstI-HF con PstI? R: El índice de fidelidad que mide las unidades mínimas para producir actividad estrella se determinó utilizando las siguientes condiciones; 1X NEBuffer, 5% glicerol, ADN Lambda (1µg/50µl), incubado durante 1 hora a 37˚C. El número mínimo de unidades de PstI-HF necesarias para producir actividad estrella en el NEBuffer 4 recomendado es de 4000 unidades. El número mínimo de unidades de PstI necesarias para producir actividad estrella en el NEBuffer 3 recomendado es de 120 unidades. El número mínimo de unidades de PstI necesarias para producir actividad estrella en el NEBuffer 4 es de 8 unidades. P: ¿Cuándo debo elegir la versión HF de una enzima? R: La versión HF de la enzima tiene la misma especificidad de escisión que la enzima de tipo salvaje y debe elegirse si la actividad estrella es un problema o si el tampón recomendado es más conveniente para la digestión doble u otro protocolo de varios pasos. No hay ninguna desventaja en usar la versión HF. P: ¿Cuándo es un problema la actividad estrella? R: La actividad estrella es un problema si las bandas adicionales pueden causar una interpretación errónea de los resultados en los procedimientos de genotipado y análisis mutacional. El diseño experimental puede promover la actividad estrella. Es más probable que los volúmenes de reacción pequeños contengan concentraciones de glicerol del 5 % o superiores, una condición que se sabe que aumenta la actividad estrella. Se produce una concentración de glicerol del 5 % al configurar una digestión doble en una reacción de 20 µl con 1 µl de cada enzima. Las digestaciones nocturnas tienen mayor probabilidad de generar actividad estrella. Para obtener consejos sobre cómo evitar la actividad estrella, haga clic aquí. P: ¿Por qué la versión HF de la enzima tiene un tampón recomendado diferente al de la enzima de tipo salvaje? R: En muchos casos, cambiar los aminoácidos cargados de un gen de endonucleasa de restricción provoca cambios en la preferencia del tampón. Estos cambios pueden ser significativos. Por ejemplo, la SalI de tipo salvaje tiene un requisito estricto para NEBuffer r3.1, un tampón de alta fuerza iónica. Sin embargo, SalI-HF funciona bien en NEBuffer r2.1 y rCutSmart Buffer™, que son tampones de fuerza iónica moderada. P: ¿Cuándo debo elegir la versión de alta fidelidad (HF®) de la enzima? R: La versión HF de la enzima tiene la misma especificidad de escisión que la enzima de tipo salvaje y debe elegirse si la actividad estrella es una preocupación o si el tampón recomendado, CutSmart®, es más conveniente para la digestión doble u otro protocolo de varios pasos. En algunos casos, las enzimas HF pueden tener diferente temperatura (o tiempo) de inactivación por calor, tolerancia a la sal y (raramente) propiedades de metilación. Obtenga más información sobre las enzimas de restricción de alta fidelidad. P: ¿Cómo se cuantifica la mejora en la fidelidad de las endonucleasas de restricción HF? R: La actividad estrella se mide utilizando un índice de fidelidad (IF). El IF de la endonucleasa de restricción de tipo salvaje se puede comparar directamente con la versión HF modificada. P: ¿Qué es el índice de fidelidad (IF)? R: "El índice de fidelidad (IF) se define como la relación entre la cantidad máxima de enzima que no muestra actividad estrella y la cantidad mínima necesaria para la digestión completa en el sitio de reconocimiento cognado para cualquier endonucleasa de restricción en particular". El valor de IF se traduce en el número mínimo de unidades que se requirieron para producir actividad estrella. El valor de FI puede verse influenciado por el sustrato, el tampón y aditivos como el glicerol. La siguiente referencia explica cómo se determina el índice de fidelidad. Hua Wei et. al. “El índice de fidelidad proporciona una cuantificación sistemática de la actividad estrella de las endonucleasas de restricción de ADN”, Nucleic Acids Research, 2008, vol. 36, n.º 9: e50. P: ¿Puede ser ventajoso el cambio en la preferencia de tampón de la enzima HF? R: Todas las enzimas de restricción HF se suministran con el tampón rCutSmart®. Las enzimas HF suelen tener un tampón óptimo diferente al de la enzima de tipo salvaje; esto puede ser ventajoso al diseñar experimentos de doble digestión. Se eligió el tampón rCutSmart como el tampón recomendado para las enzimas HF, ya que muestra el mayor nivel de compatibilidad enzimática en el sistema de tampón NEB. P: ¿Producirá la enzima HF una actividad estrella elevada cuando se use en un tampón distinto al recomendado? R: La actividad estrella se probó exhaustivamente en todos los tampones NE que mostraron al menos un 50 % de actividad enzimática. La actividad estrella se reduce significativamente en comparación con la actividad de la enzima de tipo salvaje en todos los NEBuffers. Sin embargo, recomendamos usar el tampón de reacción sugerido siempre que sea posible, ya que hay casos en los que la actividad estrella aún puede ser problemática en condiciones extremas con tampones no recomendados. P: ¿Qué significa tener la certificación Time-Saver™? R: Las enzimas con la certificación Time-Saver digieren el sustrato de ensayo unitario en 5-15 minutos en las condiciones de reacción recomendadas y también se pueden usar de forma segura en digestiones nocturnas. P: ¿A qué se refiere HF® después del nombre de una enzima de restricción? R: HF® significa alta fidelidad. Muchas endonucleasas de restricción son capaces de escindir secuencias que son similares, pero no idénticas, a su secuencia de reconocimiento definida. Esta especificidad alterada o relajada se ha denominado actividad estrella. Las endonucleasas de restricción HF se han diseñado para escindir con mayor fidelidad que la enzima de tipo salvaje, por lo que presentan una menor actividad estrella. Se utilizaron pantallas que utilizan una mayor concentración de glicerol, un mayor tiempo de reacción y una alta concentración de enzima para identificar las enzimas que ofrecerían la más alta fidelidad en una amplia gama de condiciones. Además, todas las enzimas HF se suministran con rCutSmart Buffer™, así como un vial gratuito de colorante de carga púrpura. Obtenga más información sobre las enzimas de restricción de alta fidelidad aquí. P: ¿Tengo que configurar las digestiones con enzimas calificadas Time-Saver™ durante 5 a 15 minutos? ¿Puedo digerir por más tiempo? R: Las enzimas Time-Saver™ de NEB tienen la ventaja de trabajar rápido (5-15 minutos), pero también están diseñadas y calificadas para soportar digestiones durante la noche sin degradación del ADN. P: Probé su enzima de restricción en el ADN de sustrato recomendado por NEB y parece estar activo, sin embargo, no digiere mi ADN. ¿Cuál podría ser la razón? R: La calidad y la limpieza del ADN son factores principales que pueden afectar la actividad enzimática. Las enzimas de restricción activas en el tampón rCutSmart®, pero no tan activas en los tampones NEBuffer r2.1 o r3.1 (nuestros tampones con mayor concentración de sal), pueden ser inhibidas por la sal presente en la reacción. Los procedimientos de purificación de ADN que utilizan columnas de centrifugación pueden generar soluciones de ADN con niveles significativos de sal que pueden pasar a la reacción e inhibir la actividad enzimática. Para evitar esto, recomendamos que la solución de ADN añadida a la reacción no supere el 25 % del volumen total de reacción. Esto se puede lograr ajustando el volumen total de reacción según corresponda. P: ¿Se puede almacenar el colorante de carga de gel, púrpura 6X (B7024) a bajas temperaturas? R: La temperatura de almacenamiento recomendada para el colorante de carga de gel, púrpura 6X, es temperatura ambiente (25 °C). Comúnmente, el SDS puede precipitar de la solución cuando el colorante se almacena a bajas temperaturas. Este ligero precipitado se puede disipar dejando el vial a temperatura ambiente durante una hora o calentándolo suavemente durante 10 minutos. Mezcle el vial varias veces antes de usar para homogeneizar la solución. P: ¿Qué enzimas de restricción NEB se suministran con el colorante de carga de gel morado (6X)? R: Todas las enzimas de restricción HF y la mayoría de las enzimas de restricción NEB no HF se suministran con el colorante de carga de gel morado (6X). Las enzimas de restricción no HF que vienen suministradas con el tinte púrpura son: AatII AsiSI BsmBI-v2 EagI MboI NlaIII PvuI SmaI Acil AvrII BspHI EcoRI MboII NotI RsaI SpeI AfeI BamHI BsrGI EcoRV MluI NspI SacI StuI AflII BbsI ClaI Esp3I FseI MseI PacI SacII AgeI BglII DdeI HaeIII MspI PciI SalI XbaI AluI BsaI DpnI HindIII NcoI PmeI SapI XhoI ApaI BseYI DpnII HpaI NdeI PsiI-v2 SfaNI XmaI ApeKI BsiWI DraI KpnI NheI PstI SfiI XmnI AscI * Todas las enzimas de restricción HF también se suministran con tinte de carga en gel, morado (6X) P: ¿Puedes contarme más? ¿Qué hay del cambio de BSA a albúmina recombinante (rAlbúmina) en los NEBuffers? R: En NEB nos complace anunciar que hemos cambiado los tampones de reacción con BSA (NEBuffer 1.1, 2.1, 3.1 y CutSmart® Buffer) por tampones con albúmina recombinante (NEBuffer r1.1, r2.1, r3.1 y rCutSmart™ Buffer). También estamos en proceso de adaptar todas las formulaciones de enzimas de restricción para que contengan rAlbúmina. Creemos que dejar de usar productos de origen animal es un paso en la dirección correcta y podemos ofrecer esta mejora al mismo precio. P: ¿Es compatible el colorante de carga de gel púrpura (6X) o el colorante de carga de gel púrpura (6X) sin SDS con otros colorantes de unión al ADN como SYBR® y GelRed™ durante la electroforesis en gel? R: Debido a que los colorantes de alta afinidad que se unen a los ácidos nucleicos pueden afectar la migración del ADN durante la electroforesis, se recomienda encarecidamente la tinción posterior de los geles con colorantes SYBR o GelRed. Sin embargo, estos colorantes también se pueden usar como colorantes prefabricados (en el gel de agarosa). Debido a que el colorante de carga de gel, púrpura (6X) tiene una mayor concentración en SDS, se puede observar cierta interferencia al usar SYBR o GelRed como colorantes prefabricados. Al usar estos colorantes como colorantes prefabricados, NEB recomienda usar nuestro colorante de carga de gel, púrpura, sin SDS (6X) (NEB #B7025S) en su lugar. Siga las recomendaciones a continuación para ambos colorantes púrpura cuando use colorantes SYBR como colorantes prefabricados: Reduzca la cantidad de ADN de muestra cargado a 250 a 500 ng y use solo 0,5X de colorantes SYBR en geles prefabricados. Estos colorantes son mucho más sensibles que el EtBr. Las bandas quemadas o manchadas pueden deberse a una sobrecarga. Si usa el colorante de carga de gel, púrpura (6X) B7024S, use TBE en lugar del tampón TAE, ya que la interferencia de SDS aumenta al usar el tampón TAE (en el gel y como tampón de ejecución). Use los colorantes SYBR según lo recomendado por el fabricante: agregue primero el colorante SYBR al tampón TBE y luego agregue la mezcla de colorante SYBR/TBE a la solución de agarosa fundida. Es preferible esperar unos minutos para agregar los colorantes SYBR a la agarosa fundida. Agregarlo a una solución de agarosa enfriada (por encima de la temperatura de gelificación, 45 °C) produce mejores resultados. Siempre ejecute un gel de agarosa recién hecho, para una sola ejecución. Volver a ejecutar el gel producirá un resultado deficiente. Siga las recomendaciones a continuación para ambos colorantes púrpura cuando use colorantes GelRed como colorantes prefabricados: Reduzca la cantidad de ADN de muestra cargado a 60 a 125 ng y use solo 0,5X de colorante GelRed en geles prefabricados. Este colorante es mucho más sensible que el EtBr. Las bandas quemadas o manchadas pueden deberse a una sobrecarga. Es preferible esperar unos minutos para añadir el colorante GelRed a la agarosa fundida. Añadirlo a una solución de agarosa fría (por encima de la temperatura de gelificación, 45 °C) produce mejores resultados. Siempre analice un gel de agarosa recién preparado, para una sola prueba. Repetir la prueba del gel dará resultados deficientes. SYBR® es una marca registrada de Life Technologies Corporation. GelRed™ es una marca registrada de Biotium.