Laboratorios biológicos de Nueva Inglaterra, R3150S, PvuI-HF®

PvuI-HF ha sido reformulado con albúmina recombinante (rAlbúmina) a partir del lote n.º 10128368. Categorías relacionadas Endonucleasas de restricción PR,, Endonucleasas de restricción de alta fidelidad (HF®),, Enzimas de restricción calificadas que ahorran tiempo Aplicaciones Clonación rápida: acelere sus flujos de trabajo de clonación con reactivos de NEB,, Definición de unidad de especificación de digestión con enzimas de restricción Una unidad se define como la cantidad de enzima necesaria para digerir 1 µg de ADN pXba en 1 hora a 37 °C en un volumen de reacción total de 50 μl. Condiciones de reacción Tampón rCutSmart™ 1X Incubar a 37 °C Tampón rCutSmart™ 1X Acetato de potasio 50 mM Tris-acetato 20 mM Acetato de magnesio 10 mM Albúmina recombinante 100 µg/ml (pH 7,9 a 25 °C) Actividad en tampones NE Tampón NE™ r1.1: 25 % Tampón NE™ r2.1: 100 % Tampón NE™ r3.1: 100 % Tampón rCutSmart™: 100 % Compatibilidad del diluyente Diluyente B Tampón de almacenamiento Tris-HCl 10 mM NaCl 300 mM DTT 1 mM EDTA 0,1 mM Albúmina recombinante 50 % Glicerol pH 7.4 a 25 °C Inactivación por calor Sin sensibilidad a la metilación Metilación en dam: No sensible Metilación en dcm: No sensible Metilación en CpG: Bloqueada Preguntas frecuentes P: ¿Cómo puedo buscar una enzima de restricción por secuencia, saliente o nombre? R: El buscador de enzimas, una nueva herramienta disponible en nuestro sitio web en la barra lateral bajo "Herramientas favoritas", se puede usar para buscar enzimas de restricción por nombre, secuencia, saliente o tipo. Las enzimas NEB incluyen íconos de propiedades enzimáticas y se muestran como enlaces. P: ¿Cómo debo detener mi digestión de restricción? R: Si no se planean más manipulaciones del ADN digerido, la reacción se puede terminar agregando una solución de parada. En NEB, utilizamos la siguiente solución de parada: 50 % de glicerol, 50 mM de EDTA (pH 8,0) y 0,05 % de azul de bromofenol (reacción de 10 μl / 50 μl). Si se requieren más manipulaciones del ADN digerido, la inactivación por calor (elevar la temperatura a 65 u 80 °C durante 20 minutos) es el método más sencillo para detener una reacción. Dado que este método no funciona con todas las enzimas de restricción, consulte la información del catálogo de la(s) enzima(s) que esté utilizando. La extracción con fenol/cloroformo es otro método para inactivar una enzima de restricción. P: ¿Qué tan estable es una enzima de restricción en particular? R: Todas las enzimas se analizan para determinar su actividad cada 3 a 6 meses; la fecha del ensayo más reciente se encuentra en la etiqueta adherida a cada vial de enzima. Tras treinta años de experiencia con enzimas de restricción, hemos descubierto que la mayoría son muy estables cuando se almacenan a -20 °C en el tampón de almacenamiento recomendado. La exposición a temperaturas superiores a -20 °C debe minimizarse siempre que sea posible. P: ¿Cuándo debo elegir la versión HF de la enzima? R: La versión HF de la enzima tiene la misma especificidad de escisión que la enzima de tipo salvaje y debe elegirse si la actividad estrella es preocupante o si el tampón recomendado es más conveniente para la digestión doble u otro protocolo de varios pasos. No hay ninguna desventaja en usar la versión HF. P: ¿Cuándo es preocupante la actividad estrella? R: La actividad estrella es preocupante si las bandas adicionales pueden causar una interpretación errónea de los resultados en los procedimientos de genotipado y análisis mutacional. El diseño experimental puede promover la actividad estrella. Los volúmenes de reacción pequeños tienen mayor probabilidad de contener concentraciones de glicerol del 5% o superiores, una condición que se sabe que aumenta la actividad estrella. Se produce una concentración de glicerol del 5% al ​​configurar una digestión doble en una reacción de 20 µl utilizando 1 µl de cada enzima. Las digestas nocturnas tienen mayor probabilidad de generar actividad estrella. Para obtener consejos sobre cómo evitar la actividad estrella, haga clic aquí. P: ¿Cómo debo configurar una digestión de restricción? R: La mayoría de los investigadores siguen la regla general de que 10 unidades de endonucleasa de restricción son suficientes para compensar la variabilidad en la fuente, cantidad y pureza del ADN. Generalmente, se añade 1 μl de enzima a 1 μg de ADN purificado en un volumen final de 50 μl del tampón NE 1X adecuado, seguido de una incubación de 1 hora a la temperatura recomendada. Si se utiliza un exceso de enzima, a menudo se puede reducir la duración de la incubación para ahorrar tiempo. Como alternativa, se puede digerir productivamente con menos unidades de enzima durante hasta 16 horas con muchas enzimas de restricción. Para mantener la concentración de glicerol por debajo del 5 % en una reacción, la enzima de restricción, que se suministra en glicerol al 50 %, no debe superar el 10 % del volumen total de la reacción. Un elemento extremadamente importante, aunque a menudo pasado por alto, para una digestión de restricción exitosa es la mezcla. La reacción debe estar completamente mezclada para lograr una digestión completa. Recomendamos pipetear suavemente la mezcla de reacción hacia arriba y hacia abajo o agitar el tubo de reacción. A continuación, realice una centrifugación rápida ("a toque") en una microcentrífuga. No agite la reacción en vórtex. P: No observo ninguna división después de mi digestión de restricción. ¿Qué factores pueden interferir con la escisión? R: La preparación del ADN que se va a escindir debe estar libre de contaminantes como fenol, cloroformo, alcohol, EDTA, detergentes o exceso de sales, ya que todos ellos pueden interferir con la actividad de las enzimas de restricción. La metilación del ADN también es un elemento importante de una digestión de restricción. Si tiene dificultades para escindir el sustrato de ADN, le recomendamos las siguientes reacciones de control. Incube el ADN experimental sin la enzima de restricción (la degradación del ADN indica contaminación en la preparación de ADN o el tampón de reacción) y el ADN de control (ADN con múltiples sitios conocidos para la enzima, p. ej., ADN lambda o de adenovirus-2) con la enzima de restricción para determinar con mayor precisión si la reacción se completó. Si el ADN de control se escinde y el ADN experimental resiste la escisión, se pueden mezclar ambos ADN para determinar si hay un inhibidor presente en la muestra experimental. Si hay un inhibidor (a menudo sal, EDTA o fenol), el ADN de control no se cortará después de mezclarlo. P: ¿Cómo puedo generar un mapa de sitios de enzimas de restricción para mi secuencia? R: NEBcutter®, un programa informático para el mapeo de sitios de enzimas de restricción, está disponible en el sitio web de NEB, en la barra lateral, bajo "Herramientas favoritas". El programa acepta secuencias recuperadas de un archivo local o de GenBank. También acepta una secuencia de entrada pegada en un campo designado. Al presentar una secuencia, NEBcutter encontrará los marcos de lectura abiertos más grandes dentro de la secuencia e indicará las enzimas de restricción que podrían usarse para escindir el gen. También localiza las posiciones de todas las enzimas de restricción que solo cortan una vez dentro de la secuencia seleccionada. NEBcutter también es plenamente consciente de la información sobre la sensibilidad a la metilación de las enzimas de restricción y alerta al usuario sobre la metilación superpuesta por dam, dcm, etc. P: ¿Qué información hay disponible en la Base de Datos de Enzimas de Restricción (REBASE)? R: La Base de Datos de Enzimas de Restricción (REBASE), que se encuentra en la barra lateral, bajo "Herramientas favoritas" de nuestro sitio web, es una base de datos completa con información sobre enzimas de restricción y proteínas relacionadas. Contiene referencias publicadas y no publicadas, sitios de reconocimiento y escisión, isoesquizómeros, disponibilidad comercial, sensibilidad a la metilación, datos de cristales y secuencias. También se incluyen ADN metiltransferasas, endonucleasas homing, enzimas de mellado, subunidades de especificidad y proteínas de control. Más recientemente, se han añadido posibles ADN metiltransferasas y enzimas de restricción, como se predijo a partir del análisis de secuencias genómicas. P: ¿Se recomienda la digestión prolongada (tiempos de incubación > 1 hora)? R: La definición de unidad de nuestras enzimas de restricción se basa en una incubación de 1 hora. El tiempo de incubación puede acortarse si se añaden unidades adicionales de enzima de restricción a la reacción. Por el contrario, a menudo se utilizan tiempos de incubación más largos para permitir que una reacción se complete con menos unidades de enzima. Esto depende de cuánto tiempo una enzima en particular puede sobrevivir (mantener la actividad) en una reacción. Algunas enzimas sobreviven durante largos períodos (> 16 horas), mientras que otras sobreviven solo una hora o menos en una reacción. Para cada enzima de restricción, informamos el número mínimo de unidades (1,0, 0,5, 0,25 o 0,13) necesarias para digerir 1 µg de ADN sustrato en 16 horas. Las enzimas que requieren menos de 1 unidad se pueden usar en concentraciones más bajas para tiempos de incubación más prolongados. Tenga en cuenta que los sustratos de ADN se digieren a velocidades variables, el número real de unidades necesarias para una digestión completa cambiará de sustrato a sustrato. Verifique la información individual de la enzima de restricción antes de extender los tiempos de reacción, ya que las que muestran actividad estrella se deben usar en las condiciones recomendadas para inhibir la escisión no canónica. P: ¿Los sitios de reconocimiento degenerados necesitan ser palindrómicos? R: La mayoría de los sitios de reconocimiento de enzimas de restricción son palindrómicos e incluyen solo pares de bases específicos (es decir, EcoRI reconoce GAATTC). Sin embargo, algunas enzimas tienen sitios degenerados, lo que significa que contienen uno o más pares de bases que no están específicamente definidos (es decir, BsrFI-v2 reconoce RCCGGY, donde R = A o G e Y = C o T). Para las enzimas degeneradas, cualquier base representada por el código de una sola letra puede estar presente en cualquier ubicación en el sitio de reconocimiento para que ocurra la escisión. Por ejemplo, BsrFI-v2 reconoce todas las siguientes secuencias: ACCGGC, ACCGGT, GCCGGC, GCCGGT. P: ¿A qué se refiere HF® después del nombre de una enzima de restricción? R: HF® significa alta fidelidad. Muchas endonucleasas de restricción son capaces de escindir secuencias que son similares pero no idénticas a su secuencia de reconocimiento definida. Esta especificidad alterada o relajada se ha denominado actividad estrella. Las endonucleasas de restricción HF se han diseñado para escindir con mayor fidelidad que la enzima de tipo salvaje, por lo que exhiben menos actividad estrella. Se utilizaron cribados que utilizaron una mayor concentración de glicerol, un mayor tiempo de reacción y una alta concentración de enzima para identificar las enzimas que ofrecerían la mayor fidelidad en una amplia gama de condiciones. Además, todas las enzimas HF se suministran con rCutSmart Buffer™, así como un vial gratuito de colorante de carga púrpura. Obtenga más información sobre las enzimas de restricción de alta fidelidad aquí. P: ¿Tengo que preparar las digestivas con enzimas con certificación Time-Saver™ durante 5 a 15 minutos? ¿Puedo digerir durante más tiempo? R: Las enzimas Time-Saver™ de NEB tienen la ventaja de actuar rápidamente (5 a 15 minutos), pero también están diseñadas y certificadas para soportar digestores nocturnos sin degradar el ADN. P: ¿Se puede almacenar el colorante de carga de gel, púrpura 6X (B7024) a bajas temperaturas? R: La temperatura de almacenamiento recomendada para el colorante de carga de gel, púrpura 6X, es temperatura ambiente (25 °C). Comúnmente, la SDS puede precipitar de la solución cuando el colorante se almacena a bajas temperaturas. Este ligero precipitado se puede disipar dejando el vial a temperatura ambiente durante una hora o calentándolo suavemente durante 10 minutos. Mezcle el vial varias veces antes de usarlo para homogeneizar la solución. P: ¿Qué significa la certificación Time-Saver™? R: Las enzimas con certificación Time-Saver digieren el sustrato de ensayo unitario en 5-15 minutos bajo las condiciones de reacción recomendadas y también pueden usarse con seguridad en digestores nocturnos. P: ¿Qué enzimas de restricción NEB se suministran con el colorante de carga de gel morado (6X)? R: Todas las enzimas de restricción HF y la mayoría de las enzimas de restricción NEB sin HF se suministran con el colorante de carga de gel morado (6X). Las enzimas de restricción no HF que vienen suministradas con el tinte púrpura son: AatII AsiSI BsmBI-v2 EagI MboI NlaIII PvuI SmaI Acil AvrII BspHI EcoRI MboII NotI RsaI SpeI AfeI BamHI BsrGI EcoRV MluI NspI SacI StuI AflII BbsI ClaI Esp3I FseI MseI PacI SacII AgeI BglII DdeI HaeIII MspI PciI SalI XbaI AluI BsaI DpnI HindIII NcoI PmeI SapI XhoI ApaI BseYI DpnII HpaI NdeI PsiI-v2 SfaNI XmaI ApeKI BsiWI DraI KpnI NheI PstI SfiI XmnI AscI * Todas las enzimas de restricción HF también se suministran con tinte de carga en gel, morado (6X) P: ¿Esta enzima es sensible a ¿Metilación de dam, dcm o CpG en mamíferos? R: Sí. Esta enzima no puede cortar los sitios de reconocimiento en el ADNg de mamíferos que están bloqueados por la metilación de CpG. Para obtener información actualizada sobre la sensibilidad a la metilación, visite Dam-Dcm y metilación de CpG o REBASE. P: ¿Pueden darme más información sobre la transición de BSA a albúmina recombinante (albúmina recombinante) en los tampones NEB? R: NEB se complace en anunciar que hemos cambiado los tampones de reacción con BSA (NEBuffer 1.1, 2.1, 3.1 y CutSmart® Buffer) a tampones con albúmina recombinante (NEBuffer r1.1, r2.1, r3.1 y rCutSmart™ Buffer). También estamos en proceso de migrar todas las formulaciones de enzimas de restricción para que contengan albúmina recombinante. Creemos que alejarnos de los productos que contienen productos de origen animal es un paso en la dirección correcta y podemos ofrecer esta mejora al mismo precio. P: ¿Es el colorante de carga de gel, púrpura (6X) o el colorante de carga de gel, púrpura (6X), sin SDS compatible con otros colorantes de unión al ADN como SYBR® y GelRed™ durante la electroforesis en gel? R: Debido a que los colorantes de unión a ácidos nucleicos de alta afinidad pueden afectar la migración del ADN durante la electroforesis, se recomienda encarecidamente la tinción posterior de los geles con colorantes SYBR o GelRed. Sin embargo, estos colorantes también se pueden usar como colorantes prefabricados (en el gel de agarosa). Debido a que el colorante de carga de gel, púrpura (6X) tiene una mayor concentración en SDS, se puede observar cierta interferencia al usar SYBR o GelRed como colorantes prefabricados. Al usar estos colorantes como colorantes prefabricados, NEB recomienda usar nuestro colorante de carga de gel, púrpura, sin SDS (6X) (NEB n.º B7025S) en su lugar. Por favor, siga las recomendaciones a continuación para ambos colorantes púrpura cuando use colorantes SYBR como colorantes prefabricados: Reduzca la cantidad de ADN de muestra cargado a 250 a 500 ng, y use solo 0,5X de colorantes SYBR en geles prefabricados. Estos colorantes son mucho más sensibles que el EtBr. Las bandas reventadas o manchadas pueden deberse a una sobrecarga. Si usa el colorante de carga de gel, púrpura (6X) B7024S, use TBE en lugar del tampón TAE, ya que la interferencia de SDS aumenta cuando se usa el tampón TAE (en el gel y como tampón de ejecución). Use los colorantes SYBR como lo recomienda el fabricante: agregue primero el colorante SYBR al tampón TBE, luego agregue la mezcla de colorante SYBR/TBE a la solución de agarosa fundida. Es preferible esperar unos minutos para agregar los colorantes SYBR a la agarosa fundida. Agregarlo a una solución de agarosa enfriada (por encima de la temperatura de gelificación, 45 °C) produce mejores resultados. Utilice siempre un gel de agarosa recién preparado para una sola ejecución. Repetir el análisis del gel dará resultados deficientes. Siga las recomendaciones a continuación para ambos colorantes púrpura al utilizar colorantes GelRed como colorantes prefabricados: Reduzca la cantidad de ADN de muestra cargado a 60-125 ng y utilice solo 0,5 veces el colorante GelRed en los geles prefabricados. Este colorante es mucho más sensible que el EtBr. Las bandas quemadas o manchadas pueden deberse a una sobrecarga. Es preferible esperar unos minutos para añadir el colorante GelRed a la agarosa fundida. Añadirlo a una solución de agarosa fría (por encima de la temperatura de gelificación, 45 °C) produce mejores resultados. Utilice siempre un gel de agarosa recién preparado para una sola ejecución. Repetir el análisis del gel dará resultados deficientes. SYBR® es una marca registrada de Life Technologies Corporation. GelRed™ es una marca registrada de Biotium.