Laboratorios biológicos de Nueva Inglaterra, R3195T, EcoRV-HF®

tienen la misma especificidad que las enzimas nativas, pero se han diseñado para una actividad estrella significativamente reducida y un rendimiento en un solo tampón ( Categorías relacionadas Endonucleasas de restricción CG,, Endonucleasas de restricción de alta fidelidad (HF®),, Enzimas de restricción calificadas que ahorran tiempo Aplicaciones Clonación rápida: acelere sus flujos de trabajo de clonación con reactivos de NEB,, Digestión de enzimas de restricción Definición de unidad de especificación Una unidad se define como la cantidad de enzima necesaria para digerir 1 μg de ADN λ en 1 hora a 37 °C en un volumen de reacción total de 50 μl. Condiciones de reacción Tampón rCutSmart™ 1X Incubar a 37 °C Tampón rCutSmart™ 50 mM Acetato de potasio 20 mM Tris-acetato 10 mM Acetato de magnesio 100 µg/ml Albúmina recombinante (pH 7,9 a 25 °C) Actividad en NEBuffers NEBuffer™ r1.1: 25 % NEBuffer™ r2.1: 100 % NEBuffer™ r3.1: 100 % Buffer rCutSmart™: 100 % Compatibilidad del diluyente Diluyente B Buffer de almacenamiento 10 mM Tris-HCl 200 mM NaCl 1 mM DTT 0,1 mM EDTA 200 µg/ml BSA 50 % Glicerol pH 7,4 a 25 °C Inactivación por calor 65 °C durante 20 minutos Sensibilidad a la metilación dam metilación: No sensible dcm metilación: No sensible CpG metilación: Deteriorada por algunas combinaciones de superposición Preguntas frecuentes P: ¿Hay alguna diferencia en el corte cerca de los extremos entre EcoRV-HF y EcoRV? R: No. Cuando se prueba en un Serie de cinco oligos (de 19 a 23 bases de longitud) que contiene el sitio de restricción y de 1 a 5 bases A/T adicionales desde el extremo. Ambas enzimas cortan el oligo con un par de bases desde el extremo. Al diseñar cebadores, NEB recomienda añadir 6 bases adicionales para evitar fallos experimentales debido a variaciones en el sustrato y las condiciones de reacción. P: ¿Cuál es la diferencia entre EcoRV-HF y EcoRV? R: EcoRV-HF se produce en E. coli a partir de una cepa que porta el gen EcoRV clonado y modificado del plásmido J62 pLG74 (LI Glatman). P: ¿Cuándo debo elegir la versión HF de la enzima? R: La versión HF de la enzima tiene la misma especificidad de escisión que la enzima de tipo silvestre y debe elegirse si la actividad estrella es un problema o si el tampón recomendado es más conveniente para la doble digestión u otro protocolo de varios pasos. No hay ninguna desventaja en usar la versión HF. P: ¿Cuándo es un problema la actividad estrella? R: La actividad estrella es un problema si las bandas adicionales pueden causar una interpretación errónea de los resultados. En procedimientos de genotipado y análisis mutacional. El diseño experimental puede promover la actividad estrella. Es más probable que los volúmenes de reacción pequeños contengan concentraciones de glicerol del 5 % o superiores, una condición que se sabe que aumenta la actividad estrella. Se produce una concentración de glicerol del 5 % al configurar una digestión doble en una reacción de 20 µl con 1 µl de cada enzima. Las digestaciones nocturnas tienen mayor probabilidad de generar actividad estrella. Para obtener consejos sobre cómo evitar la actividad estrella, haga clic aquí. P: ¿Por qué la versión HF de la enzima tiene un tampón recomendado diferente al de la enzima de tipo silvestre? R: En muchos casos, cambiar los aminoácidos cargados de un gen de endonucleasa de restricción provoca cambios en la preferencia del tampón. Estos cambios pueden ser significativos. Por ejemplo, la SalI de tipo silvestre tiene un requisito estricto para NEBuffer r3.1, un tampón de alta fuerza iónica. Sin embargo, SalI-HF funciona bien en NEBuffer r2.1 y rCutSmart Buffer™, que son tampones de fuerza iónica moderada. P: ¿Cuándo debo elegir la versión de alta fidelidad (HF®) de la ¿Enzima? R: La versión HF de la enzima tiene la misma especificidad de escisión que la enzima silvestre y debe elegirse si la actividad estrella es una preocupación o si el tampón recomendado, CutSmart®, es más conveniente para la digestión doble u otro protocolo de varios pasos. En algunos casos, las enzimas HF pueden tener diferente temperatura (o tiempo) de inactivación térmica, tolerancia a la sal y (raramente) propiedades de metilación. Obtenga más información sobre las enzimas de restricción de alta fidelidad. P: ¿Puede ser ventajoso el cambio en la preferencia de tampón de la enzima HF? R: Todas las enzimas de restricción HF se suministran con el tampón rCutSmart®. Las enzimas HF suelen tener un tampón óptimo diferente al de la enzima silvestre; esto puede ser ventajoso al diseñar experimentos de digestión doble. El tampón rCutSmart se eligió como el tampón recomendado para las enzimas HF, ya que muestra el mayor nivel de compatibilidad enzimática en el sistema de tampón NEB. P: ¿Producirá la enzima HF una actividad estrella elevada al usarse en un tampón diferente al recomendado? R: La actividad estrella se probó exhaustivamente en todos los tampones NEB que mostraron Al menos un 50 % de actividad enzimática. La actividad estrella se reduce significativamente en comparación con la actividad enzimática de tipo silvestre en todos los NEBuffers. Sin embargo, recomendamos usar el tampón de reacción sugerido siempre que sea posible, ya que existen casos en los que la actividad estrella puede ser problemática en condiciones extremas con tampones no recomendados. P: ¿Qué significa la certificación Time-Saver™? R: Las enzimas con certificación Time-Saver digieren el sustrato de ensayo unitario en 5-15 minutos en las condiciones de reacción recomendadas y también se pueden usar de forma segura en digestiones nocturnas. P: ¿Cómo se cuantifica la mejora en la fidelidad de las endonucleasas de restricción HF? R: La actividad estrella se mide mediante un índice de fidelidad (IF). El IF de la endonucleasa de restricción de tipo silvestre se puede comparar directamente con la versión HF modificada. P: ¿Qué es el índice de fidelidad (IF)? R: El índice de fidelidad (IF) se define como la relación entre la cantidad máxima de enzima sin actividad estrella y la cantidad mínima necesaria para una digestión completa en el sitio de reconocimiento correspondiente para cualquier endonucleasa de restricción en particular. El valor de IF se traduce en el número mínimo de unidades necesario para producir actividad estrella. El valor de FI puede verse influenciado por el sustrato, el tampón y aditivos como el glicerol. La siguiente referencia explica cómo se determina el Índice de Fidelidad: Hua Wei et al. “El Índice de Fidelidad proporciona una cuantificación sistemática de la actividad estrella de las endonucleasas de restricción de ADN”, Nucleic Acids Research, 2008, Vol. 36, N.° 9: e50. P: ¿A qué se refiere HF® después del nombre de una enzima de restricción? R: HF® significa alta fidelidad. Muchas endonucleasas de restricción son capaces de escindir secuencias similares, pero no idénticas, a su secuencia de reconocimiento definida. Esta especificidad alterada o relajada se ha denominado actividad estrella. Las endonucleasas de restricción HF se han diseñado para escindir con mayor fidelidad que la enzima de tipo silvestre, por lo que presentan una menor actividad estrella. Se utilizaron pruebas de cribado con mayor concentración de glicerol, mayor tiempo de reacción y alta concentración de enzima para identificar las enzimas que ofrecerían la mayor fidelidad en un amplio rango de condiciones. Además, todas Las enzimas HF se suministran con el tampón rCutSmart™ y un vial gratuito de colorante de carga púrpura. Obtenga más información sobre las enzimas de restricción de alta fidelidad aquí. P: ¿Tengo que preparar las digestivas con enzimas con certificación Time-Saver™ durante 5 a 15 minutos? ¿Puedo digerir durante más tiempo? R: Las enzimas Time-Saver™ de NEB tienen la ventaja de actuar rápidamente (5 a 15 minutos), pero también están diseñadas y certificadas para soportar digestores nocturnos sin degradación del ADN. P: ¿Se puede almacenar el colorante de carga de gel púrpura 6X (B7024) a bajas temperaturas? R: La temperatura de almacenamiento recomendada para el colorante de carga de gel púrpura 6X es temperatura ambiente (25 °C). Comúnmente, el SDS puede precipitar de la solución cuando el colorante se almacena a bajas temperaturas. Este ligero precipitado se puede disipar dejando el vial a temperatura ambiente durante una hora o calentándolo suavemente durante 10 minutos. Mezcle el vial varias veces antes de usarlo para que la solución vuelva a su temperatura ambiente. homogeneidad. P: ¿Qué enzimas de restricción NEB se suministran con el tinte de carga en gel, morado (6X)? R: Todas las enzimas de restricción HF y la mayoría de las enzimas de restricción NEB no HF se suministran con tinte de carga en gel, morado (6X). Las enzimas de restricción no HF que vienen suministradas con el tinte púrpura son: AatII AsiSI BsmBI-v2 EagI MboI NlaIII PvuI SmaI Acil AvrII BspHI EcoRI MboII NotI RsaI SpeI AfeI BamHI BsrGI EcoRV MluI NspI SacI StuI AflII BbsI ClaI Esp3I FseI MseI PacI SacII AgeI BglII DdeI HaeIII MspI PciI SalI XbaI AluI BsaI DpnI HindIII NcoI PmeI SapI XhoI ApaI BseYI DpnII HpaI NdeI PsiI-v2 SfaNI XmaI ApeKI BsiWI DraI KpnI NheI PstI SfiI XmnI AscI * Todas las enzimas de restricción HF también se suministran con colorante de carga de gel, púrpura (6X). P: ¿Es esta enzima sensible a la metilación de CpG de DAM, DCM o mamíferos? R: Sí. Esta enzima no puede cortar los sitios de reconocimiento en el ADNg de mamíferos que se ven afectados por algunas combinaciones de metilación de CpG superpuesta. Para obtener información actualizada sobre las sensibilidades a la metilación, visite Dam-DCM y metilación de CpG o REBASE. P: ¿Puede contarme más sobre el cambio de BSA a albúmina recombinante (rAlbúmina) en los tampones NEBuffer? R: NEB se complace en anunciar que hemos cambiado los tampones de reacción que contienen BSA (NEBuffer 1.1, 2.1, 3.1 y CutSmart® Buffer) a tampones que contienen albúmina recombinante (NEBuffer r1.1, r2.1, r3.1 y tampón rCutSmart™). También estamos en proceso de adaptar todas las formulaciones de enzimas de restricción para que contengan rAlbúmina. Consideramos que dejar de usar productos con ingredientes de origen animal es un paso en la dirección correcta y podemos ofrecer esta mejora al mismo precio. P: ¿Es compatible el colorante de carga de gel, púrpura (6X) o el colorante de carga de gel, púrpura (6X), sin SDS, con otros colorantes de unión al ADN como SYBR® y GelRed™ durante la electroforesis en gel? R: Dado que los colorantes de unión a ácidos nucleicos de alta afinidad pueden afectar la migración del ADN durante la electroforesis, se recomienda encarecidamente la tinción posterior de los geles con colorantes SYBR o GelRed. Sin embargo, estos colorantes también se pueden usar como colorantes prefabricados (en el gel de agarosa). Dado que el colorante de carga de gel, púrpura (6X), tiene una mayor concentración en SDS, se pueden observar algunas interferencias al usar SYBR o GelRed como colorantes prefabricados. Al usar estos colorantes como colorantes prefabricados, NEB recomienda usar nuestro colorante de carga de gel, morado, sin SDS (6X) (NEB n.° B7025S). Siga las recomendaciones a continuación para ambos colorantes morados al usar colorantes SYBR como colorantes prefabricados: Reduzca la cantidad de ADN de muestra cargado a 250-500 ng y use solo 0,5X de colorantes SYBR en geles prefabricados. Estos colorantes son mucho más sensibles que el EtBr. Las bandas quemadas o manchadas pueden deberse a una sobrecarga. Si usa el colorante de carga de gel, morado (6X) B7024S, use TBE en lugar del tampón TAE, ya que la interferencia de SDS aumenta al usar el tampón TAE (en el gel y como tampón de ejecución). Use los colorantes SYBR según las recomendaciones del fabricante: agregue primero el colorante SYBR al tampón TBE y luego agregue la mezcla de colorante SYBR/TBE a la solución de agarosa fundida. Es preferible esperar unos minutos para agregar los colorantes SYBR a la solución fundida. Agarosa. Añadirla a una solución de agarosa fría (por encima de la temperatura de gelificación, 45 °C) produce mejores resultados. Analice siempre un gel de agarosa recién preparado, para una sola ejecución. Repetir el análisis del gel dará resultados deficientes. Siga las siguientes recomendaciones para ambos colorantes púrpura al utilizar colorantes GelRed como colorantes prefabricados: Reduzca la cantidad de ADN de muestra cargado a 60-125 ng y utilice solo 0,5 veces el colorante GelRed en los geles prefabricados. Este colorante es mucho más sensible que el EtBr. Las bandas quemadas o manchadas pueden deberse a una sobrecarga. Es preferible esperar unos minutos para añadir el colorante GelRed a la agarosa fundida. Añadirlo a una solución de agarosa fría (por encima de la temperatura de gelificación, 45 °C) produce mejores resultados. Analice siempre un gel de agarosa recién preparado, para una sola ejecución. Repetir el análisis del gel dará resultados deficientes. SYBR® es una marca registrada de Life Technologies Corporation. GelRed™ es una marca registrada. de Biotio