Laboratorios biológicos de Nueva Inglaterra, R3505M, EagI-HF®

EagI-HF se ha reformulado con albúmina recombinante (rAlbúmina) a partir del lote n.º 10215285. Categorías relacionadas Endonucleasas de restricción CG,, Endonucleasas de restricción de alta fidelidad (HF®),, Enzimas de restricción calificadas que ahorran tiempo Aplicaciones Clonación rápida: acelere sus flujos de trabajo de clonación con reactivos de NEB,, Definición de unidad de especificación de digestión con enzimas de restricción Una unidad se define como la cantidad de enzima necesaria para digerir 1 µg de ADN pXba en 1 hora a 37 °C en un volumen de reacción total de 50 μl. Condiciones de reacción Tampón rCutSmart™ 1X Incubar a 37 °C Tampón rCutSmart™ 1X Acetato de potasio 50 mM Tris-acetato 20 mM Acetato de magnesio 10 mM Albúmina recombinante 100 µg/ml (pH 7,9 a 25 °C) Actividad en tampones NE Tampón NE™ r1.1: 25 % Tampón NE™ r2.1: 100 % Tampón NE™ r3.1: 100 % Tampón rCutSmart™: 100 % Compatibilidad del diluyente Diluyente B Tampón de almacenamiento Tris-HCl 10 mM NaCl 500 mM DTT 1 mM EDTA 0,1 mM Albúmina recombinante 200 µg/ml Glicerol al 50 % pH 7,5 a 25 °C Inactivación por calor 65 °C durante 20 minutos Sensibilidad a la metilación dam methylation: No sensible dcm methylation: No sensible CpG Metilación: Bloqueada Preguntas frecuentes P: ¿Existe alguna diferencia en la sensibilidad a la metilación entre EagI-HF y EagI? R: Tanto EagI-HF como EagI están bloqueados por la metilación de CpG. Para obtener información más específica sobre la metilación, siga el enlace a la base de datos de enzimas de restricción REBASE. P: ¿Cuál es la diferencia entre EagI-HF y EagI? R: EagI-HF ha sido diseñado con una mutación para exhibir significativamente menos actividad estrella y viene suministrado con rCutSmart Buffer. P: ¿Cuándo debo elegir la versión HF de una enzima? R: La versión HF de la enzima tiene la misma especificidad de escisión que la enzima de tipo salvaje y debe elegirse si la actividad estrella es una preocupación o si el tampón recomendado es más conveniente para la digestión doble u otro protocolo de varios pasos. No hay ninguna desventaja en usar la versión HF. P: ¿Cuándo es preocupante la actividad estrella? R: La actividad estrella es preocupante si las bandas adicionales pueden causar una interpretación errónea de los resultados en los procedimientos de genotipado y análisis mutacional. El diseño experimental puede promover la actividad estrella. Es más probable que los volúmenes de reacción pequeños contengan concentraciones de glicerol del 5% o superiores, una condición que se sabe que aumenta la actividad estrella. Una concentración de glicerol del 5% ocurre al configurar una digestión doble en una reacción de 20 µl usando 1 µl de cada enzima. Las digestaciones nocturnas son más propensas a generar actividad estrella. Para obtener consejos sobre cómo evitar la actividad estrella, haga clic aquí. P: ¿Por qué la versión HF de la enzima tiene un tampón recomendado diferente al de la enzima de tipo silvestre? R: En muchos casos, cambiar los aminoácidos cargados de un gen de endonucleasa de restricción resulta en cambios en la preferencia del tampón. Estos cambios pueden ser significativos. Por ejemplo, la SalI de tipo silvestre tiene un requisito estricto para NEBuffer r3.1, un tampón de alta fuerza iónica. Sin embargo, SalI-HF funciona bien en NEBuffer r2.1 y rCutSmart Buffer™, que son tampones de fuerza iónica moderada. P: ¿Cuándo debo elegir la versión de alta fidelidad (HF®) de la enzima? R: La versión HF de la enzima tiene la misma especificidad de escisión que la enzima de tipo silvestre y debe elegirse si la actividad estrella es una preocupación o si el tampón recomendado, CutSmart®, es más conveniente para la digestión doble u otro protocolo de varios pasos. En algunos casos, las enzimas HF pueden tener diferente temperatura (o tiempo) de inactivación térmica, tolerancia a la sal y (raramente) propiedades de metilación. Obtenga más información sobre las enzimas de restricción de alta fidelidad. P: ¿Puede ser ventajoso el cambio en la preferencia de tampón de la enzima HF? R: Todas las enzimas de restricción HF se suministran con el tampón rCutSmart®. Las enzimas HF suelen tener un tampón óptimo diferente al de la enzima de tipo silvestre; esto puede ser ventajoso al diseñar experimentos de digestión doble. El tampón rCutSmart se eligió como el tampón recomendado para las enzimas HF, ya que muestra el mayor nivel de compatibilidad enzimática en el sistema de tampones NEB. P: ¿Producirá la enzima HF una actividad estrella elevada al utilizarse en un tampón distinto al recomendado? R: La actividad estrella se analizó exhaustivamente en todos los tampones NE que mostraron al menos un 50 % de actividad enzimática. La actividad estrella se reduce significativamente en comparación con la actividad enzimática de tipo salvaje en todos los tampones NE. Sin embargo, recomendamos utilizar el tampón de reacción sugerido siempre que sea posible, ya que en algunos casos la actividad estrella puede ser problemática en condiciones extremas con tampones no recomendados. P: ¿Qué significa la certificación Time-Saver™? R: Las enzimas con certificación Time-Saver digieren el sustrato de ensayo unitario en 5-15 minutos en las condiciones de reacción recomendadas y también pueden utilizarse de forma segura en digestores nocturnos. P: ¿Cómo se cuantifica la mejora en la fidelidad de las endonucleasas de restricción HF? R: La actividad estrella se mide mediante un índice de fidelidad (IF). El FI de la endonucleasa de restricción de tipo salvaje se puede comparar directamente con la versión HF modificada. P: ¿Qué es el Índice de Fidelidad (FI)? R: “El Índice de Fidelidad (FI) se define como la relación entre la cantidad máxima de enzima que no muestra actividad estrella y la cantidad mínima necesaria para una digestión completa en el sitio de reconocimiento cognado para cualquier endonucleasa de restricción en particular”. El valor de FI se traduce en el número mínimo de unidades que se requirió para producir actividad estrella. El valor de FI puede verse influenciado por el sustrato, el tampón y aditivos como el glicerol. La siguiente referencia explica cómo se determina el Índice de Fidelidad. Hua Wei et. al. “El Índice de Fidelidad proporciona una cuantificación sistemática de la actividad estrella de las endonucleasas de restricción de ADN”, Nucleic Acids Research, 2008, Vol. 36, No. 9: e50. P: ¿Hay alguna diferencia en el corte cerca de los extremos entre EagI-HF y EagI? R: No. Al analizar una serie de cinco oligos (de 19 a 23 bases de longitud) que contienen el sitio de restricción y de 1 a 5 bases A/T adicionales desde el extremo, ambas enzimas cortan el oligo con 2 pares de bases desde el extremo. Al diseñar cebadores, NEB recomienda añadir 6 bases adicionales para evitar fallos experimentales debido a variaciones en el sustrato y las condiciones de reacción. P: ¿A qué se refiere HF® después del nombre de una enzima de restricción? R: HF® significa alta fidelidad. Muchas endonucleasas de restricción son capaces de escindir secuencias similares, pero no idénticas, a su secuencia de reconocimiento definida. Esta especificidad alterada o relajada se ha denominado actividad estrella. Las endonucleasas de restricción HF se han diseñado para escindir con mayor fidelidad que la enzima de tipo silvestre, por lo que presentan una menor actividad estrella. Se utilizaron pantallas que utilizan una mayor concentración de glicerol, un mayor tiempo de reacción y una alta concentración de enzima para identificar las enzimas que ofrecerían la más alta fidelidad en una amplia gama de condiciones. Además, todas las enzimas HF se suministran con rCutSmart Buffer™, así como un vial gratuito de colorante de carga púrpura. Obtenga más información sobre las enzimas de restricción de alta fidelidad aquí. P: ¿Tengo que configurar las digestiones con enzimas calificadas Time-Saver™ durante 5 a 15 minutos? ¿Puedo digerir por más tiempo? R: Las enzimas Time-Saver™ de NEB tienen la ventaja de trabajar rápido (5-15 minutos), pero también están diseñadas y calificadas para soportar digestiones durante la noche sin degradación del ADN. P: ¿Se puede almacenar el colorante de carga de gel, púrpura 6X (B7024) a bajas temperaturas? R: La temperatura de almacenamiento recomendada para el colorante de carga de gel, púrpura 6X, es temperatura ambiente (25 °C). Comúnmente, el SDS puede precipitar de la solución cuando el colorante se almacena a bajas temperaturas. Este ligero precipitado puede disiparse dejando el vial a temperatura ambiente durante una hora o calentándolo suavemente durante 10 minutos. Mezcle el vial varias veces antes de usarlo para homogeneizar la solución. P: ¿Qué enzimas de restricción NEB se suministran con el colorante de carga de gel morado (6X)? R: Todas las enzimas de restricción HF y la mayoría de las enzimas de restricción NEB sin HF se suministran con el colorante de carga de gel morado (6X). Las enzimas de restricción no HF que vienen suministradas con el tinte púrpura son: AatII AsiSI BsmBI-v2 EagI MboI NlaIII PvuI SmaI Acil AvrII BspHI EcoRI MboII NotI RsaI SpeI AfeI BamHI BsrGI EcoRV MluI NspI SacI StuI AflII BbsI ClaI Esp3I FseI MseI PacI SacII AgeI BglII DdeI HaeIII MspI PciI SalI XbaI AluI BsaI DpnI HindIII NcoI PmeI SapI XhoI ApaI BseYI DpnII HpaI NdeI PsiI-v2 SfaNI XmaI ApeKI BsiWI DraI KpnI NheI PstI SfiI XmnI AscI * Todas las enzimas de restricción HF también se suministran con tinte de carga en gel, morado (6X) P: ¿Esta enzima es sensible a ¿Metilación de dam, dcm o CpG en mamíferos? R: Sí. Esta enzima no puede cortar los sitios de reconocimiento en el ADNg de mamíferos que están bloqueados por la metilación de CpG. Para obtener información actualizada sobre la sensibilidad a la metilación, visite Dam-Dcm y metilación de CpG o REBASE. P: ¿Pueden darme más información sobre la transición de BSA a albúmina recombinante (albúmina recombinante) en los tampones NEB? R: NEB se complace en anunciar que hemos cambiado los tampones de reacción con BSA (NEBuffer 1.1, 2.1, 3.1 y CutSmart® Buffer) a tampones con albúmina recombinante (NEBuffer r1.1, r2.1, r3.1 y rCutSmart™ Buffer). También estamos en proceso de migrar todas las formulaciones de enzimas de restricción para que contengan albúmina recombinante. Creemos que alejarnos de los productos que contienen ingredientes de origen animal es un paso en la dirección correcta y podemos ofrecer esta mejora al mismo precio. P: Para las enzimas almacenadas a -80 °C, ¿se ve afectada la actividad enzimática después de múltiples ciclos de congelación/descongelación? R: Las siguientes enzimas mantuvieron su actividad completa cuando se probaron durante 10 ciclos de congelación-descongelación. Si necesita más de 10 ciclos de congelación-descongelación, recomendamos dividir la enzima en alícuotas más pequeñas y congelar cada alícuota a -80 °C. Cac8I EagI-HF I-SceI KasI NlaIII Tenga en cuenta que FseI mantuvo su actividad completa durante solo 5 ciclos de congelación/descongelación. P: ¿El colorante de carga de gel, púrpura (6X) o el colorante de carga de gel, púrpura (6X), sin SDS, es compatible con otros colorantes de unión al ADN como SYBR® y GelRed™ durante la electroforesis en gel? R: Debido a que los colorantes de alta afinidad que se unen a los ácidos nucleicos pueden afectar la migración del ADN durante la electroforesis, se recomienda encarecidamente la tinción posterior de los geles con colorantes SYBR o GelRed. Sin embargo, estos colorantes también se pueden usar como colorantes prefabricados (en el gel de agarosa). Debido a que el colorante de carga de gel, púrpura (6X) tiene una mayor concentración en SDS, se puede observar cierta interferencia al usar SYBR o GelRed como colorantes prefabricados. Al usar estos colorantes como colorantes prefabricados, NEB recomienda usar nuestro colorante de carga de gel, púrpura, sin SDS (6X) (NEB #B7025S) en su lugar. Siga las recomendaciones a continuación para ambos colorantes púrpura cuando use colorantes SYBR como colorantes prefabricados: Reduzca la cantidad de ADN de muestra cargado a 250 a 500 ng y use solo 0,5X de colorantes SYBR en geles prefabricados. Estos colorantes son mucho más sensibles que el EtBr. Las bandas quemadas o manchadas pueden deberse a una sobrecarga. Si usa el colorante de carga de gel, púrpura (6X) B7024S, use TBE en lugar del tampón TAE, ya que la interferencia de SDS aumenta al usar el tampón TAE (en el gel y como tampón de ejecución). Use los colorantes SYBR según lo recomendado por el fabricante: agregue primero el colorante SYBR al tampón TBE y luego agregue la mezcla de colorante SYBR/TBE a la solución de agarosa fundida. Es preferible esperar unos minutos para agregar los colorantes SYBR a la agarosa fundida. Agregarlo a una solución de agarosa enfriada (por encima de la temperatura de gelificación, 45 °C) produce mejores resultados. Siempre ejecute un gel de agarosa recién hecho, para una sola ejecución. Volver a ejecutar el gel producirá un resultado deficiente. Siga las recomendaciones a continuación para ambos colorantes púrpura cuando use colorantes GelRed como colorantes prefabricados: Reduzca la cantidad de ADN de muestra cargado a 60 a 125 ng y use solo 0,5X de colorante GelRed en geles prefabricados. Este colorante es mucho más sensible que el EtBr. Las bandas quemadas o manchadas pueden deberse a una sobrecarga. Es preferible esperar unos minutos para añadir el colorante GelRed a la agarosa fundida. Añadirlo a una solución de agarosa fría (por encima de la temperatura de gelificación, 45 °C) produce mejores resultados. Siempre analice un gel de agarosa recién preparado, para una sola prueba. Repetir la prueba del gel dará resultados deficientes. SYBR® es una marca registrada de Life Technologies Corporation. GelRed™ es una marca registrada de Biotium.