Laboratorios biológicos de Nueva Inglaterra, R3539M, BbsI-HF®

Aprenda sobre la fidelidad de la ligasa y supere los límites de las categorías relacionadas Endonucleasas de restricción de alta fidelidad (HF®), Endonucleasas de restricción B, Enzimas de restricción calificadas que ahorran tiempo Aplicaciones Soluciones de automatización y clonación de alto rendimiento, Ensamblaje NEBridge® Golden Gate, Especificación de digestión con enzimas de restricción Definición de unidad Una unidad se define como la cantidad de enzima necesaria para digerir 1 µg de ADN λ en 1 hora a 37 °C en un volumen de reacción total de 50 μl. Condiciones de reacción Tampón rCutSmart™ 1X Incubar a 37 °C Tampón rCutSmart™ 1X Acetato de potasio 50 mM Tris-acetato 20 mM Acetato de magnesio 10 mM Albúmina recombinante 100 µg/ml (pH 7,9 a 25 °C) Actividad en tampones NE Tampón NE™ r1.1: 10 % Tampón NE™ r2.1: 10 % Tampón NE™ r3.1: 10 % Tampón rCutSmart™: 100 % Compatibilidad del diluyente Diluyente B Tampón de almacenamiento Tris-HCl 10 mM NaCl 300 mM DTT 1 mM EDTA 0,1 mM Albúmina recombinante 50 % Glicerol pH 7,4 @ 25 °C Inactivación por calor 65 °C durante 20 minutos Sensibilidad a la metilación dam methylation: No sensible dcm methylation: No sensible CpG Metilación: No sensible Preguntas frecuentes P: ¿A qué se refiere HF® después del nombre de una enzima de restricción? R: HF significa alta fidelidad. Muchas endonucleasas de restricción son capaces de escindir secuencias que son similares pero no idénticas a su secuencia de reconocimiento definida. Esta especificidad alterada o relajada se ha denominado actividad estrella. Las endonucleasas de restricción HF se han diseñado para escindir con mayor fidelidad que la enzima de tipo salvaje, por lo que exhiben menos actividad estrella. Se utilizaron cribados que utilizan una mayor concentración de glicerol, un mayor tiempo de reacción y una alta concentración de enzima para identificar enzimas que ofrecerían la mayor fidelidad en una amplia gama de condiciones. Además, todas las enzimas HF se suministran con rCutSmart Buffer, así como con un vial gratuito de colorante de carga púrpura. P: ¿Tengo que preparar las digestivas con enzimas con certificación Time-Saver™ durante 5-15 minutos? ¿Puedo digerir durante más tiempo? R: Las enzimas Time-Saver™ de NEB tienen la ventaja de actuar rápidamente (5-15 minutos), pero también están diseñadas y certificadas para soportar digestivas nocturnas sin degradación del ADN. P: ¿Qué enzimas de restricción de NEB se suministran con el colorante de carga de gel morado (6X)? R: Todas las enzimas de restricción con HF y la mayoría de las enzimas de restricción de NEB sin HF se suministran con el colorante de carga de gel morado (6X). Las enzimas de restricción no HF que vienen suministradas con el tinte púrpura son: AatII AsiSI BsmBI-v2 EagI MboI NlaIII PvuI SmaI Acil AvrII BspHI EcoRI MboII NotI RsaI SpeI AfeI BamHI BsrGI EcoRV MluI NspI SacI StuI AflII BbsI ClaI Esp3I FseI MseI PacI SacII AgeI BglII DdeI HaeIII MspI PciI SalI XbaI AluI BsaI DpnI HindIII NcoI PmeI SapI XhoI ApaI BseYI DpnII HpaI NdeI PsiI-v2 SfaNI XmaI ApeKI BsiWI DraI KpnI NheI PstI SfiI XmnI AscI * Todas las enzimas de restricción HF también se suministran con tinte de carga en gel, morado (6X) P: ¿Qué enzimas de restricción son ¿Se utiliza en el ensamblaje GoldenBraid? R: BsaI es una enzima de tipo IIS que se utiliza en este método. NEB también ofrece una versión de alta fidelidad de esta enzima, BsaI-HF®v2, que cuenta con la ventaja adicional de estar certificada como Time-Saver™ (puede digerir el ADN en 5-15 minutos y se puede digerir de forma segura durante la noche) y presenta una actividad estrella reducida. BsaI-HFv2 funciona en el tampón CutSmart®, al igual que la ADN ligasa T4 (también parte del flujo de trabajo GoldenBraid), que es 100 % funcionalmente activa en este tampón cuando la reacción se complementa con 1 mM de ATP. Otras enzimas de tipo IIS que se utilizan en GoldenBraid incluyen BsmBI-v2/Esp3I, BtgZI, BbsI/BbsI-HF y PaqCI (isoesquizómero AarI con secuencia de reconocimiento de 7 pb). Referencia: GoldenBraid 2.0: Un marco integral de ensamblaje de ADN para la biología sintética de plantas. P: ¿Qué enzimas de restricción se utilizan en el ensamblaje Golden Gate? R: El ensamblaje Golden Gate es un método de clonación eficiente en un solo tubo basado en enzimas de restricción de tipo IIS que escinden fuera de sus sitios de reconocimiento y dejan salientes de 3 o 4 bases. BsaI es la enzima de tipo IIS más utilizada para el ensamblaje Golden Gate. NEB también ofrece una versión de alta fidelidad de esta enzima, BsaI-HF®v2, que cuenta con la ventaja adicional de estar certificada por Time-Saver™ (puede digerir el ADN en 5-15 minutos o durante la noche sin degradarlo) y presenta una actividad estrella drásticamente reducida. Otras enzimas de tipo IIS utilizadas en el ensamblaje Golden Gate incluyen BsmBI-v2/Esp3I, BbsI/BbsI-HF, PaqCI (isoesquizómero AarI con secuencia de reconocimiento de 7 pb) y SapI/BspQI/BspQI-HF (con secuencia de reconocimiento de 7 pb y salientes de 3 pb). P: ¿Es esta enzima sensible a la metilación de CpG de dam, dcm o mamíferos? R: No. Esta enzima no es sensible a la metilación de CpG de dam, dcm o mamíferos. Para obtener información actualizada sobre la sensibilidad a la metilación, visite Dam-Dcm y metilación de CpG o REBASE. P: ¿Ofrece NEB enzimas de restricción sin BSA ni de origen animal para la linealización de plásmidos para el desarrollo de vacunas de ARNm? R: Sí, NEB ha formulado algunas enzimas de restricción (incluida BspQI, un isoesquizómero de SapI) sin componentes derivados de animales y no aparece BSA en su formulación final. Además, tenemos varias enzimas de restricción disponibles sin BSA ni otros componentes derivados de animales en su formulación final. Esta lista incluye: BbsI-HF BsaI-HFv2 BspQI, isoesquizómero de LguI, grado GMP* ahora disponible BspQI-HF ClaI HindIII-HF PacI SapI SpeI SwaI XbaI XhoI XmnI Se pueden formular otras enzimas a pedido. Por favor, pregunte aquí. * "Grado GMP" y "grado GMP" son términos de marca que NEB utiliza para describir los productos fabricados o terminados en las instalaciones de Rowley de NEB. Las instalaciones de Rowley fueron diseñadas para fabricar productos bajo una infraestructura y controles de proceso más rigurosos para lograr especificaciones de producto y requisitos de los clientes más estrictos. Los productos fabricados en las instalaciones de NEB en Rowley se fabrican de conformidad con las normas de gestión de calidad ISO 9001 e ISO 13485. Sin embargo, actualmente, NEB no fabrica ni vende productos conocidos como Ingredientes Farmacéuticos Activos (API), ni fabrica sus productos de conformidad con todas las normas vigentes de Buenas Prácticas de Manufactura (BPM). P: ¿Podrían darme más información sobre la transición de BSA a albúmina recombinante (rAlbúmina) en los tampones NEBuffer? R: NEB se complace en anunciar que hemos cambiado los tampones de reacción con BSA (NEBuffer 1.1, 2.1, 3.1 y CutSmart® Buffer) por tampones con albúmina recombinante (NEBuffer r1.1, r2.1, r3.1 y rCutSmart™ Buffer). También estamos en proceso de migrar todas las formulaciones de enzimas de restricción para que contengan rAlbúmina. Creemos que dejar de usar productos de origen animal es un paso en la dirección correcta y podemos ofrecer esta mejora al mismo precio. P: ¿Se puede almacenar el colorante de carga en gel, morado 6X (B7024) a bajas temperaturas? R: La temperatura de almacenamiento recomendada para el colorante de carga en gel, morado 6X, es la temperatura ambiente (25 °C). Es común que la SDS se precipite de la solución cuando el colorante se almacena a bajas temperaturas. Este ligero precipitado se puede disipar dejando el vial a temperatura ambiente durante una hora o calentándolo suavemente durante 10 minutos. Mezcle el vial varias veces antes de usarlo para homogeneizar la solución.